Фбс расшифровка в строительстве: Расшифровка ФБС — правильный вариант

Разработка комбинаторных и динамических декодеров с использованием синтетических генов немедленного раннего развития

Разработка SynIEG для мониторинга индукции целевого гена

Наша стратегия создания синтетических целевых генов основана на обширных классических исследованиях с использованием анализов репортерных генов для изучения функции энхансеров, промоторов и РНК / белковые элементы ^14,15,16,17 . В нашем случае кассета синтетических генов-мишеней должна соответствовать двум взаимодополняющим целям. Во-первых, SynIEG должен легко модифицироваться и вводиться для реализации различных форм регуляции на уровне мРНК или белка.Таким образом, каждый SynIEG объединяет сигнально-чувствительный промотор, 5′- и 3′-регуляторные последовательности мРНК и кодирующие белок последовательности в плазмиду, которая может быть нацелена на геномную интеграцию (рис. 2а, дополнительное примечание 1), и в следующем разделе мы убедитесь, что эти случайно интегрированные гены обнаруживают ответы, которые соответствуют их эндогенным аналогам (Fig. 2, Supplementary Figs. 1–4). Во-вторых, количественное понимание декодирования сигналов требует способности отслеживать динамические ответы на уровне мРНК и белка в отдельных клетках с течением времени, двойные возможности, которые редко предоставляются в классических анализах репортерных генов ^14,15,16,17 .Основываясь на недавнем быстром развитии репортеров транскрипции и трансляции живых клеток ^18,19,20 и стратегии, которую мы недавно разработали для эндогенных генов-мишеней ²¹ , мы включили тег YFP-24xMS2 в каждый SynIEG. В этой системе мгновенную транскрипцию можно визуализировать как яркое ядерное пятно, когда возникающие петли РНК MS2 связаны с флуоресцентным РНК-связывающим белком MCP-mCherry, а накопление белка можно контролировать с помощью флуоресценции YFP. В качестве первого тестового примера мы объединили область 2 т.п.н. перед сайтом начала транскрипции FOS , который содержит его промотор и канонические вышестоящие регуляторные элементы ^22,23 , FOS 5’UTR, кодирующую последовательность для мономерной суперпапка YFP (msfYFP), стебель-петля РНК 24xMS2 и 3’UTR TUBA1B в одном лентивирусном векторе, который мы назвали fos-tubulin для его 5′- и 3′-элементов соответственно (рис.2b) и вводил его в клональную клеточную линию NIh4T3, уже экспрессирующую MCP-mCherry и h3B-iRFP в качестве ядерного маркера (линия клеток «шасси»; см. «Методы») ²¹ .

Рис. 2: Разработка синтетических генов-мишеней Ras / Erk, которые воспроизводят эндогенную кинетику транскрипции.

a Схематический обзор синтетических генов-мишеней, включающих многоступенчатую регуляцию. Сигнальные входы могут действовать на уровне транскрипции посредством регуляции промотора / энхансера (1), на уровне мРНК посредством регуляции на основе UTR (2) и на уровне белка через домены или линейные мотивы, реагирующие на передачу сигналов (3). b Дизайн синтетических немедленных ранних генов (SynIEGs). Erk-чувствительный промотор FOS ( pFOS ) управляет экспрессией желтого флуоресцентного белка (YFP), за которым следуют 24 стволовые петли MS2, которые позволяют визуализировать накопление белка и транскрипцию, соответственно, в живых клетках. Элементы мРНК UTR и белковые дегроны могут быть добавлены для модуляции стабильности мРНК и белка. Репрезентативные изображения в разные моменты времени одной клетки, экспрессирующей SynIEG, содержащей FOS, 5 ‘UTR и TUBULIN 3′ UTR, до и после стимуляции сывороткой как для транскрипции, так и для трансляции. Транскрипционный фокус локализации MCP-mCherry обозначен красной стрелкой. Данные для дополнительных ячеек показаны на дополнительном рис. 1. Масштабная шкала для 10 мкм. c Изображения ядер NIh4T3 после индукции транскрипции SynIEG содержат FOS, 5′-UTR и BTG2 3′-UTR в несколько моментов времени после стимуляции сывороткой. Очаги транскрипции обозначены красными стрелками. Шкала 10 мкм. d Количественная оценка восьми транскрипционных фокусов в клетке, показанной в c , показывая отдельные следы (слева), их среднее значение + SD (справа).Транскрипционные ответы от 10 дополнительных клеток показаны на дополнительном рисунке 3.

Затем мы проверили, можно ли использовать SynIEGs для определения регуляторных шагов, которые позволяют генам-мишеням избирательно реагировать на динамику восходящей передачи сигналов. Мы сосредоточились на гене FOS , поскольку его регуляция является каноническим примером динамического декодирования: устойчивая, но не временная активация пути Ras / MAPK вызывает повышение уровней белка Fos ^11,12 . Таким образом, мы решили сконструировать варианты FOS SynIEG, чтобы резюмировать его динамическую фильтрацию (рис.3а).

a Схема платформы для проверки того, может ли синтетическая регуляторная цепь немедленного раннего гена воспроизводить динамическую фильтрацию посредством немедленного раннего гена FOS с использованием оптогенетической системы OptoSOS для применения динамических стимулов (см. Дополнительный рисунок 5). b Перечень деталей динамического фильтра, работающего только на длительный срок службы. FOS 3 ‘UTR подвержен деградации вторым Erk-индуцированным предранним геном, Zfp36 (верхняя панель).Уровни белка стабилизируются фосфорилированием Erk последовательности degron семейства Fos (нижняя панель). c , d Количественная оценка индукции YFP в зависимости от продолжительности светового стимула для fos-tubulin SynIEG (в c ) и fos -Fra1deg- fos SynIEG, реализующих Fos-специфическую мРНК- и регуляция уровня белка (в d ). Кратность изменения флуоресценции YFP количественно оценивали по NIH 3T3, которые также экспрессировали систему iLID-OptoSOS и стимулировались либо временным (20 минут), либо постоянным (90 минут) синим светом.Все кривые показывают среднее значение ± SEM для n = 10 ячеек (панель c , устойчивый), n = 6 ячеек (панель c , переходный), n = 22 ячейки (панель d , устойчивый), и n = 23 ячейки (панель d , переходная). e Схема комбинаторного контроля над индукцией BTG2 : стимуляция Erk индуцирует транскрипцию btg2, но не накопление белка, тогда как повреждение ДНК вызывает и то, и другое. Механизм, лежащий в основе этого различия, неизвестен. f Типичные изображения уровней YFP в клональных линиях NIh4T3, экспрессирующих различные SynIEG и стимулированных 10% сывороткой. На изображениях показаны уровни YFP непосредственно до и через 3 часа после стимуляции сывороткой, а масштабная линейка — 10 мкм. г Количественное определение площади под кривой (AUC) индукции YFP после стимуляции сывороткой для клональных клеточных линий SynIEG, показанных в f , а также для fos-tubulin в качестве дополнительного контроля (см. Подробные сведения о методах количественной оценки. ).Каждая точка представляет собой среднее значение 20–30 клеток из независимого эксперимента. ч Количественная оценка флуоресценции YFP в клетках NIh4T3, несущих fos — btg2 SynIEG и стимулированных 10% сывороткой после нулевой трансдукции ( n = 20 клеток), miR-21 ( n = 17 клеток ) или губки miR-21 ( n = 21 клетка). Одноклеточные кривые показаны более светлым цветом, а средний ответ показан жирной линией. Дополнительные клоны, протестированные на эффект miR-21, показаны на дополнительном рис.8.

Считается, что динамическая фильтрация с помощью FOS зависит от экспрессии генов, а также от двух форм посттранскрипционной регуляции, Erk-зависимой дестабилизации 3′-UTR FOS ²⁶ и стабилизации белка Fos ¹¹ , хотя не исключены и дополнительные формы регулирования. Таким образом, мы проверили, действительно ли минимальный набор регуляторных элементов способен к динамической фильтрации. Мы объединили промотор FOS , FOS 3’UTR и хорошо охарактеризованный Erk-чувствительный дегрон из члена семейства FOS Fra1 ²⁷ для создания SynIEG, названного fos- Fra1 ^deg -fos (Рисунок.3б). fos-tubulin SynIEG использовали в качестве контроля, лишенного обеих форм посттранскрипционной регуляции. Мы ввели оба SynIEG в «шасси» клеток NIh4T3, которые также были отсортированы для экспрессии оптогенетической системы для включения пути Erk, системы OptoSOS, чувствительной к синему свету (iLID-OptoSOS) ^16,17 , которая позволяет нам точно контролировать динамика активности пути путем варьирования продолжительности освещения (дополнительный рис. 5a). В отсутствие синего света SSPB-SOScat является цитозольным и неактивным, тогда как стимуляция синим светом вызывает локализацию мембраны SSPB-SOScat (дополнительный рис.5b ) и активирует передачу сигналов Ras / Erk (Supplementary Fig. 5c-e).

Мы инкубировали клетки OptoSOS-SynIEG в бессывороточной среде в течение 6 часов, применяя либо 20-минутный импульс света («переходный»), либо непрерывное освещение («устойчивое»), и отслеживали индукцию YFP с течением времени (рис. 3c). , г). Для клеток fos-tubulin оба световых стимула вызывали одинаковое увеличение флуоресценции YFP с течением времени (рис. 3c), вероятно, потому, что как устойчивые, так и временные стимулы, активирующие Erk, вызывают идентичный импульс транскрипции, как наблюдалось ранее (рис.2, дополнительный рисунок 4) и в предыдущих исследованиях ²¹ . Однако мы обнаружили, что в клональной клеточной линии fos -Fra1 ^deg — fos устойчивый свет приводил к большему накоплению белка, чем 20-минутный световой импульс (рис. 3d). Таким образом, кажется, что две посттранскрипционные регуляторные связи, содержащиеся в fos -Fra1 ^deg — fos SynIEG (Erk-зависимая стабилизация белка и деградация мРНК), действительно достаточны для обеспечения динамической селективности в отношении устойчивых стимулов Erk.

Мы также наблюдали, что кратность изменения экспрессии белка SynIEG была относительно низкой: 40% в случае fos-tubulin и 20% в случае fos -Fra1 ^deg — fos клеток более 3-часовой временной курс (рис. 3в, г). Мы предположили, что это низкое кратное изменение может отражать высокую стабильность трансгена YFP, что приводит к его неспособности «сбросить» до низкого уровня в среде голодания перед добавлением сыворотки. Для дальнейшего изучения этой гипотезы мы сравнили fos-fos SynIEG клеток с ранее полученным клоном NIh4T3 с YFP-меченным эндогенным геном FOS ²¹ .Обе клеточные линии голодали в бессывороточной среде в течение 5 часов, а затем стимулировали сывороткой для запуска экспрессии YFP. Действительно, хотя кратность увеличения эндогенных уровней FOS была выше, чем у fos-fos SynIEG (дополнительный рис. 6a), количественная оценка интегрированной исходной флуоресценции показала, что fos-fos SynIEG имел сопоставимые, если не выше, количество индукции общего белка (дополнительная фиг. 6b ) . Эти результаты обосновали разработку последующих схем SynIEG с использованием дестабилизированных флуоресцентных репортеров, описанных далее на рис.4.

a Схематическое изображение предшествующих знаний о регуляции FOS и BTG2 в ответ на стимуляцию фактора роста (сыворотка) и повреждение ДНК (доксорубицин; Dox). Как транскрипция Fos, так и накопление белка запускаются сывороточной стимуляцией независимо от повреждения ДНК (верхние панели). Напротив, транскрипция btg2 индуцируется как повреждением ДНК, так и стимуляцией сыворотки, но только повреждение ДНК запускает накопление белка Btg2. b Схема синтетического логического элемента И, отвечающего как на стимуляцию сывороткой, так и на повреждение ДНК. Комбинируя транскрипционный ответ, подобный FOS, , с ответом белка, подобного BTG2 , индукция целевого гена будет запускаться только при подаче обоих стимулов. c Экспериментальная реализация SynIEG логического элемента AND. Транскрипция fos-btg2 SynIEG индуцируется только сывороточной стимуляцией, а не повреждением ДНК из-за использования промотора FOS .Однако повреждение ДНК необходимо для накопления белка за счет использования BTG2 3’UTR. d Транскрипционный ответ fos-btg2 SynIEG. Яркость отдельных ядерных очагов MCP-mCherry была определена количественно (среднее + стандартное отклонение) в клетках, обработанных доксорубицином ( n = 17 очагов, 17 клеток), сыворотке ( n = 26 очагов, 12 клеток) или их комбинации ( n = 25 очагов, 10 ячеек). e Индукция GFP от fos-btg2 SynIEG.Уровни ядерного dGFP определяли количественно из клеток, стимулированных доксорубицином, сывороткой или их комбинацией. Трассы отдельных ячеек показаны серым цветом, а средний ответ показан черной линией. f Количественное определение площади под кривой (AUC) индукции dGFP для линий клональных клеток SynIEG, показанных на d и e , после стимуляции сывороткой, доксорубицином или их комбинацией (подробности количественной оценки см. В разделе «Методы») . Каждая точка представляет собой среднее значение не менее 20 клеток в одном эксперименте, причем каждая полоса представляет собой среднее значение трех независимых повторных экспериментов.Статистические данные получены с использованием непарного двустороннего теста t (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).

SynIEGs раскрывают основу

Затем мы обратили наше внимание на специфическое для стимула стробирование BTG2 , где требования к экспрессии белка в ответ на различные восходящие сигналы все еще плохо изучены ²⁸ . BTG2 транскрипция индуцируется многими клеточными стимулами, от факторов роста ²¹ до повреждений ДНК ^29,30 и других стрессов ³¹ .Различные клеточные стимулы также, по-видимому, регулируют BTG2 на этапах транскрипции и посттранскрипции. Например, мы ранее наблюдали, что уровни белка Btg2 не изменялись в клетках NIh4T3 после стимуляции фактором роста, несмотря на устойчивую индукцию мРНК btg2. Напротив, повреждение ДНК, вызванное ингибитором топоизомеразы доксорубицином, запускало как транскрипцию, так и индукцию на уровне белка Btg2 ²¹ (рис. 3e). Мы рассудили, что, конструируя SynIEGs, включающие различные элементы гена BTG2 , мы могли бы идентифицировать источник специфичного для стимула стробирования и сгенерировать модульный компонент, который можно было бы перепрофилировать для разработки дополнительных логических функций.

Наша первая цель состояла в том, чтобы определить, происходит ли этот блок накопления белка Btg2 после передачи сигналов фактора роста на уровне мРНК (например, путем регулирования деградации мРНК или блокирования трансляции) или на уровне белка (например, путем регулирования деградации белка). Чтобы проверить регуляцию уровня мРНК, мы сконструировали серию вариантов SynIEG, в которых отсутствовала какая-либо последовательность белка Btg2, но содержались различные комбинации последовательностей UTR BTG2 и FOS (названных btg2-btg2 , btg2 — fos). , fos-btg2 и fos-fos SynIEG).Мы получили клональные клеточные линии для каждого SynIEG, голодали каждую в течение 4-6 часов, а затем стимулировали сывороткой для мониторинга индукции YFP, используя идентично обработанные fos-tubulin SynIEG клетки в качестве контроля (дополнительный рис. 7). Мы обнаружили, что только SynIEGs, содержащие 3 ‘UTR BTG2 , не смогли накапливать YFP в ответ на стимуляцию сывороткой (рис. 3f, g), тогда как все другие SynIEGs демонстрировали аналогичные уровни накопления YFP. BTG2 3′-UTR может в принципе ограничивать накопление YFP ​​либо за счет запуска деградации мРНК, либо за счет блокирования трансляции белка.Однако ранее мы обнаружили, что уровни эндогенной мРНК btg2 остаются высокими в течение нескольких часов после стимуляции сывороткой, даже если белок не производится, тогда как повреждение ДНК запускает индукцию как уровня мРНК, так и уровня белка ²¹ . Вместе эти данные демонстрируют, что регуляция уровня РНК достаточна для объяснения парадоксального ответа Btg2, заключающегося в высокой сывороточной экспрессии без накопления белка, и предполагает механизм репрессии трансляции, опосредованной 3′-UTR BTG2 .

Предыдущие сообщения показывают, что более дюжины микроРНК могут связываться с 3 ‘UTR BTG2 и регулировать экспрессию белка Btg2 в различных типах клеток и раковых опухолях ^{32,33,34,35,36} .Мы сосредоточились на miR-21 как на кандидате в регулятор, потому что он активируется после стимуляции фактором роста (в отличие от большинства микроРНК) ³⁷ , и потому что miR-21 участвует в регуляции Btg2 в других контекстах ^34,35 . Чтобы проверить, отвечает ли miR-21 за репрессию трансляции Btg2 после острой стимуляции фактором роста, мы создали клеточные линии, которые сверхэкспрессируют miR-21 или антисмысловую «губку» для титрования эндогенного miR-21, полагая, что эти конструкции должны иметь противоположные эффекты на Накопление YFP.Мы создали лентивирусные векторы экспрессии, содержащие промотор U6, управляющий либо miR-21, либо антисмысловой губкой, с последующим конститутивным промотором CMV, управляющим экспрессией TagBFP-NLS для мечения клеток, которые были успешно трансдуцированы. Мы обнаружили, что клетки SynIEG, трансдуцированные губкой miR-21, проявляют индукцию YFP после стимуляции сывороткой, тогда как клетки, трансдуцированные ложно или трансдуцированные miR-21, не могут накапливать накопление YFP ​​(рис. 3h, дополнительный рис. 8). Эти данные подтверждают модель, согласно которой передача сигналов фактора роста управляет транскрипцией BTG2 и , но miR-21 блокирует трансляцию Btg2 с этой мРНК.В целом, наши результаты согласуются с предыдущими сообщениями о репрессии BTG2 в других клеточных контекстах ³⁵ и с сообщениями, указывающими, что miR-21 может блокировать трансляцию целевых мРНК ^38,39,40,41 . В более широком смысле, мы обнаружили, что SynIEG представляют собой гибкую систему для изучения декодирования клеточных сигнальных стимулов на нескольких этапах в соответствии с центральной догмой, от индукции транскрипции (например, кинетики транскрипции с помощью визуализации MS2 / MCP) до регуляции трансляции (например.g., тестирование различных 5′- и 3′-регуляторных последовательностей) регуляции на уровне белка (например, Erk-зависимая стабилизация Fra1 degron).

Разработка сенсора SynIEG митогенов и повреждений ДНК

Помимо анализа регуляции естественных немедленных ранних генов, SynIEG также хорошо подходят для конструирования цепей, реагирующих на передачу сигналов, с ранее неизвестными функциями желаемого ответа. Чтобы изучить эту возможность, мы затем приступили к разработке SynIEG, который реализует функцию передачи сигналов-ответа, которая ранее не была описана для какого-либо немедленного-раннего гена: ворота И, в которых стимуляция фактором роста и второй стимул, повреждение ДНК, оба одновременно необходимы для индукции экспрессии гена.

Наша стратегия разработки SynIEG с логическим элементом AND основана на перепрофилировании и объединении регулирующих элементов FOS и BTG2 , описанных в предыдущих разделах. Ранее мы наблюдали, что ген FOS транскрибируется в ответ на стимуляцию фактора роста, независимо от того, присутствует ли повреждение ДНК ²¹ (рис. 4a). Напротив, репрессия трансляции на основе 3′-UTR гена BTG2 отменяется в клетках, подвергшихся повреждению ДНК, доставленных либо отдельно, либо в сочетании с сывороткой ²¹ (рис.4а). При объединении эти два регуляторных элемента могут, таким образом, привести к цепи, которая требует двух входов: сыворотки для обеспечения транскрипции и повреждения ДНК для снятия репрессии трансляции (Fig. 4b). Все компоненты, необходимые для реализации такого логического элемента И, будут закодированы в одном трансгене, что подчеркивает эффективность нашего подхода.

Мы сконструировали кандидатный И-вентиль SynIEG, объединив промотор FOS и 5′-UTR, 3′-UTR BTG2 и кодирующую последовательность, управляющую экспрессией дестабилизированного варианта GFP (dGFP).Мы выбрали dGFP вместо нашего предыдущего репортера YFP, чтобы «сбросить» схему до более низкого исходного уровня во время инкубации в бессывороточной среде перед стимуляцией, потенциально увеличивая кратность изменения экспрессии трансгена (рис. 4c). Конститутивный промотор CMV, управляющий экспрессией TagBFP, был помещен ниже по течению в том же векторе интеграции, чтобы сделать возможной независимую от схемы селекцию клеток NIh4T3, трансдуцированных PiggyBAC. Затем мы выполнили сортировку отдельных клеток, чтобы получить две независимые клональные клеточные линии, экспрессирующие кандидатный И-вентиль SynIEG.

Мы охарактеризовали ответы на уровне мРНК и белка клеток, экспрессирующих кандидатный ИГ-гейт SynIEG, в ответ на три класса стимулов: доксорубин (только повреждение ДНК), 1% сыворотка (только фактор роста) или доксорубицин + 1% сыворотки (Повреждение ДНК И фактор роста). На уровне транскрипции мы наблюдали выраженные очаги MCP в клетках SynIEG-ворот AND, обработанных сывороткой, независимо от того, присутствовал ли доксорубицин (рис. 4d), что согласуется с нашими предыдущими наблюдениями из эндогенного локуса FOS ²¹ .На уровне белка dGFP не может накапливаться или слабо реагирует ни на доксорубицин, ни на только сыворотку, тогда как комбинация сыворотки и доксорубицина запускает сильное накопление dGFP (рис. 4e, дополнительный рис. 9a). Мы также подтвердили, что общее изменение флуоресценции dGFP (площадь под кривой; AUC) было существенно увеличено за счет комбинации сыворотки и доксорубицина по сравнению с любым входом отдельно в обеих независимо полученных клональных клеточных линиях (фиг.4f, дополнительный рисунок 9b) .Кроме того, управляющий SynIEG ( fos — fos ) не демонстрировал логику логического элемента AND, что исключает возможность того, что логика, подобная логическому элементу AND, возникла из-за факторов, которые были внешними для нашей схемы (дополнительный рис. 9c). Взятые вместе, эти данные демонстрируют успешное построение гена, который синергетически реагирует на комбинацию входных сигналов митогена и повреждения ДНК с использованием компонентов немедленного раннего гена. Экспрессия желаемой генетической нагрузки становится возможной, когда стимуляция фактора роста индуцирует транскрипцию SynIEG, а повреждение ДНК снимает опосредованную микроРНК репрессию трансляции.Несмотря на этот успех, мы отмечаем, что слабая активация только в ответ на сыворотку не позволяет характеризовать ее как идеальный вентиль AND. Дальнейшие улучшения могут подавлять эту слабую активацию, например включение дополнительных сайтов связывания miR-21 в 3′-UTR для усиления репрессии трансляции. Тем не менее, поскольку, насколько нам известно, о супераддитивной логике не сообщалось ни для одного эндогенного немедленного-раннего гена, наши результаты демонстрируют, что платформу SynIEG можно использовать для создания новых отношений сигнал-ответ, а также для анализа эндогенных регуляторных связей IEG.

Эффективное обратное декодирование скрытых марковских моделей высокого порядка

Алгоритм прямого-обратного поиска (FBS) [S. Остин, Р. Шварц, П. Плейсвей, Алгоритм прямого-обратного поиска, в: Proceedings of the IEEE International Conference on Acoustics, Speech and Signal Processing, 1991, pp. 697–700], привел к увеличению скорости до 40 в дорогостоящих синхронных по времени поисках лучей в распознавании речи на основе скрытой марковской модели (HMM) [R. Шварц, С. Остин, Эффективные высокопроизводительные алгоритмы поиска N-лучшего, в: Труды семинара по речи и естественному языку, 1990, стр.6–11; Л. Нгуен, Р. Шварц, Ф. Кубала, П. Плейсвей, Алгоритмы поиска для распознавания только программного обеспечения в реальном времени с очень большими словарями, в: Proceedings of the Workshop on Human Language Technology, 1993, pp. 91–95; A. Sixtus, S. Ortmanns, Высококачественные графы слов с использованием прямого и обратного отсечения, в: Proceedings of the IEEE International Conference on Acoustics, Speech and Signal Processing, 1999, pp. 593–596]. Обычно это достигается за счет использования упрощенного прямого поиска для уменьшения объема вычислений в следующем подробном обратном поиске.FBS неявно предполагает, что прямой и обратный поиск HMM вычислительно эквивалентен. В этой статье мы представляем экспериментальные результаты, полученные в базе данных CallFriend, которые показывают, что это предположение неверно для обычных HMM высокого порядка. Следовательно, любое улучшение вычислительной эффективности, которое достигается за счет использования обычных HMM низкого порядка в упрощенном обратном поиске FBS, теряется. Эта проблема решается путем представления нового определения HMM, называемого HMM правого контекста, которое эквивалентно традиционному HMMs.Мы показываем, что вычислительные затраты на обратное декодирование HMM правого контекста с помощью луча Витерби аналогичны расходам на прямое декодирование обычных HMM. Хотя это и не является предметом данной статьи, это позволяет нам более эффективно декодировать HMM высокого порядка за счет повышения вычислительной эффективности, которое достигается с помощью алгоритма FBS.

Получение взаимодействий хроматина с высоким разрешением и регуляторный потенциал энхансера декодирования in silico

% PDF-1.5 % 1 0 объект > / Метаданные 902 0 R / Страницы 2 0 R / StructTreeRoot 3 0 R / Тип / Каталог >> эндобдж 902 0 объект > поток application / pdf

Контролируемое кальмодулином пространственное декодирование колебательных сигналов Ca2 + кальциневрином

В новую заявку был внесен ряд изменений, в том числе несколько новых экспериментов, и мы считаем, что эти изменения полностью снимают опасения, высказанные рецензентами.

Рецензент 1:

1) Учитывая, что кальмодулин ограничивает, избыточная экспрессия кальмодулин-связывающих репортеров, вероятно, нарушит нормальный баланс.Как уровень CaNAR2 соотносится с эндогенным NFAT? Если CaNAR2 более высоко экспрессируется в ER, чем в цитозоле, это может объяснить разницу. Точно так же детектор конформации CaNARi может быть выражен на более низком уровне. Необходимо измерить уровни экспрессии и подтвердить их эквивалентность .

Рецензент поднимает важный вопрос относительно уровней экспрессии биосенсора. К сожалению, после поиска в литературе и консультаций со сторонними экспертами мы не смогли найти никаких конкретных данных об уровнях эндогенной экспрессии различных изоформ NFAT.Тем не менее, мы использовали очищенный YFP для калибровки подсчетов интенсивности, полученных на нашем микроскопе, и на основе этой калибровки мы смогли оценить, что внутриклеточная концентрация cytoCaNAR2 в наших экспериментах колебалась между примерно 45 нМ и 4 мкМ. Важно отметить, что мы также обнаружили, что паттерны ответа, сообщаемые каждым субклеточным нацеленным вариантом CaNAR2, остаются стабильными в аналогичных диапазонах уровней экспрессии биосенсора, и раздел результатов был обновлен, чтобы отразить это открытие (см. Рисунок 2 — рисунок в приложении 1).Точно так же мы не обнаружили значимой корреляции между уровнями экспрессии сенсора конформации кальциневрина (CaNARi) или зонда Ca ²⁺ / CaM (BSCaM-2) и наблюдаемыми ими изменениями соотношения FRET. Основываясь на этих данных, мы заключаем, что экспрессия биосенсора не повлияла на наши опубликованные наблюдения.

2) Следует исключить роль запасов кальция в ER, например используя соответствующие препараты .

Мы исследовали это с использованием субклеточно-нацеленных версий GCaMP3, котрансфицированных вместе с диффундирующим RCaMP, и мы не наблюдали различий между локальной динамикой Ca ²⁺ в цитозоле, на поверхности ER или даже на плазматической мембране по сравнению с глобальным Ca ²⁺ динамика.В исправленную рукопись добавлены данные об ER и цитозоле. Кроме того, хотя нацеленный на ER GCaMP3 показал, что базальные уровни Ca ²⁺ рядом с ER дрейфуют вверх во время колебаний, этот базальный дрейф не влияет на реакцию erCaNAR, предполагая, что запасы ER не играют значительной роли в дифференциальной активности кальциневрина. Мы действительно обнаружили незначительную разницу в амплитуде Ca ²⁺ на поверхности ER по сравнению с цитозолем, и рукопись была обновлена, чтобы отразить это наблюдение; однако тот факт, что изменение одного кальмодулина, либо за счет сверхэкспрессии, либо за счет ингибирования W7, может изменить характер активности кальциневрина, указывает на более прямую роль кальмодулина.

3) Коколебание ПКА и кальция не является неожиданным, но мешает четкой интерпретации данных. Результаты были бы более убедительными, если бы активность PKA была буферизирована для предотвращения колебаний .

Как было предложено рецензентом, мы обновили рисунок 5 экспериментами, в которых активность PKA фиксировалась на постоянном уровне. Для этого мы предварительно обработали клетки ингибитором панфосфодиэстеразы IBMX, что привело к максимальной активности PKA, а затем обработали эти клетки повторными дозами KCl с последующей промывкой.Мы не наблюдали различий в паттернах ответа CaNAR в этих условиях по сравнению с условиями, в которых активность PKA позволяла колебаться, то есть cytoCaNAR2 имел интегрирующий ответ, а erCaNAR2 имел колебательный ответ.

4) Эффект сверхэкспрессии кальмодулина должен дополняться ингибированием кальмодулина. Низкие дозы миРНК кальмодулина W7 или кальмодулина должны вызывать колебания фосфорилирования NFAT в цитозоле, а также ER .

Мы благодарим рецензента за предложение этого эксперимента.Мы действительно обнаружили, что предварительная обработка клеток MIN6 субмаксимальной дозой (20 мкМ) W7 с последующим повторным введением KCl вызывает полностью колебательные ответы от cytoCaNAR2. Эти новые данные были добавлены на рис. 9 в измененной рукописи.

5) Из модели не ясно, почему датчик конформации кальциневрина колеблется в ER. Величина колебаний FRET аналогична в ER и цитозоле на показанных графиках. Если бы кальмодулин был ограничивающим, можно было бы ожидать меньшей величины.Объяснение неясно и требует разрешения .

Учитывая, что активация и, следовательно, конформация кальциневрина строго контролируется цитозольным повышением Ca ²⁺ , колебания Ca ²⁺ , как ожидается, будут вызывать колебательную активацию кальциневрина, даже если активируется меньше кальциневрина. Кроме того, поскольку ответ FRET от этого датчика невелик, он не может надежно сообщать о различиях в амплитуде активации кальциневрина.Тем не менее, основываясь на этом комментарии, мы более внимательно сравнили амплитуды ответа и обнаружили, что ответы от митохондриальных и ER-направленных CaNARi были в действительности меньше в среднем, чем ответы от цитозольных и плазматических мембран CaNARi. Эти данные теперь обобщены на Рисунке 7B отредактированной рукописи. Хотя разница не была статистически значимой, наблюдаемая тенденция поддерживает нашу модель, и мы благодарим рецензента за побуждение к более тщательному анализу наших данных.

Рецензент 2:

1) Я не понимаю, почему область митохондрий отличается от ответа цитозоля .

Мы решили сосредоточиться на различной динамике активности между поверхностью ER и цитозолем. Динамика активности на внешней митохондриальной мембране была подобна той, что наблюдалась в ER, и лежащие в основе механизмы будут изучены в будущих исследованиях.

2) Мне также интересно, отличаются ли колебания кальция вблизи плазмы или мембраны ЭР, таким же образом, как реакции кальциневрина. Сильная поддержка получена из экспериментов, в которых CaM сверхэкспрессируется, а датчик, расположенный в ER, имитирует расположение цитозоля и плазматической мембраны.Чего не хватает, так это альтернативного эксперимента, в котором кальциневрин должен блокироваться умеренными уровнями W-7. Это должно привести к идеальным колебаниям кальциневрина везде .

Различие в моделях колебаний также может быть обусловлено активностью соответствующих мембран, например притоком кальция к плазматической мембране или более эффективным поглощением кальция SERCA рядом с ER. Эти возможности не исследовались и не обсуждаются .

Как упоминалось выше в ответ на обзор 1, мы не наблюдали различий между колебаниями Ca ²⁺ в цитозоле, на поверхности ER или на плазматической мембране (измерено с использованием субклеточно нацеленного GCaMP3) и глобальным Ca ²⁺ колебания (измеренные одновременно с использованием диффузного RCaMP), предполагая, что локальные сигналы Ca ²⁺ не являются определяющим фактором для дифференциальных ответов кальциневрина.Кривые GCaMP / RCaMP для цитозоля и ER были добавлены в исправленную рукопись (рис. 8).

Мы благодарим рецензента за предложение этого эксперимента. Как упоминалось выше, мы действительно обнаружили, что предварительная обработка клеток MIN6 субмаксимальной дозой (20 мкМ) W7 с последующим повторным добавлением и вымыванием KCl вызывает полностью колебательные ответы от cytoCaNAR2. Эти новые данные были добавлены на рис. 9 в измененной рукописи.

3) Точно так же эффекты ингибиторов PKA и PKC могут сильно влиять на кальциевые каналы, включая рецептор IP3, и, следовательно, могут изменять пороговый уровень кальция, необходимый для успешных колебаний.Гипотеза о том, что происходит утечка кальция близко к ER, является слабым объяснением устойчивого увеличения активности кальциневрина после Goe6983 и H89 .

Автор обзора прав в том, что ингибирование PKA или PKC может изменить поведение каналов Ca ²⁺ . Например, было показано, что PKA стимулирует активность как VGCC L-типа, так и рецептора IP3; таким образом, ингибирование PKA должно приводить к снижению притока Ca ²⁺ , что мы и наблюдаем на рисунке 3A.Напротив, было показано, что PKC ингибирует оба этих канала, и мы также видим на рисунке 3C, что ингибирование PKC приводит к увеличению уровней Ca ²⁺ и, потенциально, к увеличению активности кальциневрина (см. Ответы на обзор 1 выше). Принимая во внимание, что увеличение активности кальциневрина после ингибирования PKC явно связано с повышенным уровнем Ca ²⁺ , мы приписали повышенную активность кальциневрина после ингибирования PKA утечке Ca ²⁺ из-за снижения уровня Ca ²⁺ и вероятного снижение опосредованного IP3R высвобождения Ca ²⁺ , хотя последнее может все еще иметь эффект.

4) Представленная модель основана на том факте, что Ca / CaM активирует кальциневрин. Однако ранее было показано, что активации кальций-зависимых фосфатаз, таких как PP1, достаточно, чтобы вызвать колебания кальция в отсутствие деполяризации, вероятно, за счет изменения уровня фосфорилирования рецептора IP3 (Reither et al., 2013). Вызывает ли активация кальциневрина кальциевые сигналы? Если бы это было так, модель должна была бы быть намного сложнее .

Кальциневрин взаимодействует с каналами высвобождения ER Ca ²⁺ , такими как рецептор IP3, и потенциально может модулировать их активность, хотя это остается несколько спорным.Кроме того, кальциневрин, как известно, ингибирует приток через каналы плазматической мембраны Ca ²⁺ . Следовательно, более вероятно, что кальциневрин модулирует существующие сигналы Ca ²⁺ , а не индуцирует их как таковые. Возможно, что кальциневрин оказывает другие эффекты, стимулируя приток Ca ²⁺ ; однако в настоящее время нет убедительных доказательств, которые заставили бы нас двигаться в этом направлении.

5) Я доверяю утверждению о том, что CaM может быть мало в некоторых клетках, но насколько много его в клетках Min6? По крайней мере, оценка транскриптома должна была быть предоставлена, поскольку заключение о субклеточных различиях в Ca / CaM основано на предположении редкости.Кроме того, если концентрация CaM действительно была в диапазоне менее 100 нМ, то сверхэкспрессия белка, связывающего CaM (обычно в микромолярном диапазоне), определенно будет буферизировать CaM вблизи его местоположения на мембране ER. Есть вероятность, что либо CaM достаточно, либо, если нет, датчик выдает артефакт. Боюсь, что авторам не удастся выиграть в этом. Был ли BSCaM-2 также прикреплен к плазматической мембране и использован ли там для определения концентрации CaM? В заключение, хотя это очень интересно, существует слишком много открытых вопросов и слишком много экспериментов, которые необходимо провести, чтобы принять этот документ .

Мы не использовали этот подход на основе BSCaM-2 для определения концентрации свободного Ca ²⁺ / CaM; скорее, нашей целью было просто сравнить относительные уровни Ca ²⁺ / CaM в разных компартментах, как это было ранее сделано с использованием этих зондов (Teruel et al., 2000). Насколько нам известно, эту информацию трудно получить другими методами. BSCaM-2, нацеленный на цитозольную мембрану и плазматическую мембрану, показал идентичный ответ (80,61 ± 0,03% против 79,15 ± 0,04% изменения соотношения FRET), тогда как ответ на поверхности ER был ниже (50.74 ± 0,03%), предполагая, что уровень свободного Ca ²⁺ / CaM ниже в этом отсеке. В экспериментах с BSCaM-2 не отслеживались никакие нижестоящие процессы передачи сигналов, тем самым ограничивая потенциал для эффектов буферизации, и мы также не обнаружили корреляции между экспрессией зонда и ответом FRET в большом диапазоне уровней экспрессии, которые, как мы ожидали увидеть, были уровни биосенсора, влияющие на результаты. Более того, сверхэкспрессия CaM или ингибирование CaM с использованием W7 явно модулирует ответы ER и цитозольный CaNAR, соответственно, не говоря уже о том факте, что избыточная экспрессия CaM спасает ответ BSCaM-2 на поверхности ER (70.03 ± 0,03%). Эти наблюдения, в частности, убедительно свидетельствуют о том, что уровни свободного Ca ²⁺ / CaM ограничиваются вблизи поверхности ER, что приводит к более слабой активации кальциневрина в этом месте. Сходные наблюдения были сделаны Теруэлем и коллегами, которые сообщили о меньшем увеличении уровней свободного ядерного Ca ²⁺ / CaM по сравнению с цитозолем в ответ на переходные процессы Ca ²⁺ (Teruel et al., 2000). Мы процитировали их исследование в рукописи.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Направленная вставка цистеина путем декодирования кодонов UGA с помощью селеноцистеинового механизма млекопитающих

Abstract

Цистеин (Cys) вставляется в белки в ответ на кодоны UGC и UGU. Здесь мы показываем, что добавление тиофосфата к клеткам млекопитающих привело к направленной вставке Cys в кодон UGA тиоредоксинредуктазы 1 (TR1). Этот Cys был синтезирован селеноцистеин (Sec) синтазой на тРНК ^{[Ser] Sec} , и его вставка зависела от элемента последовательности вставки Sec в 3’UTR мРНК TR1.Субстрат для этой реакции, тиофосфат, был синтезирован селенфосфатсинтетазой 2 из АТФ и сульфида и реагировал с фосфосерил-тРНК ^{[Ser] Sec} с образованием цис-тРНК ^{[Ser] Sec} . Cys был вставлен in vivo в кодоны UGA в естественных TR млекопитающих, и этот процесс регулировался диетическим селеном и доступностью тиофосфата. Cys обнаруживается на уровне 10% от уровней Sec в TR1 печени мышей, находящихся на диете с нормальным количеством селена, и на 50% в TR1 печени мышей, находящихся на диете с дефицитом селена.Эти данные раскрывают новый механизм биосинтеза и встраивания Cys в белок в кодонах UGA, основанный на Sec, и предполагают новые биологические функции тиофосфата и сульфида у млекопитающих.

Цистеин (Cys) — одна из 20 природных аминокислот, обычно используемых в синтезе белка. Он кодируется генетическими кодовыми словами UGC и UGU. Каталитические окислительно-восстановительные остатки Cys в белках функционально подобны селеноцистеину (Sec) (1). Sec, известная как 21-я аминокислота в генетическом коде, кодируется кодоном UGA и вставляется котрансляционно во время синтеза белка на основе рибосом (2–4).Однако для кодонов UGA, которые диктуют вставку Sec, а не прекращение синтеза белка, соответствующие мРНК также должны содержать структуру РНК «стебель-петля», называемую элементом последовательности вставки Sec (SECIS) (5). Элементы SECIS имеют разные структуры в трех доменах жизни и расположены в 3′-UTR эукариотических генов, в 3′-UTR или 5′-UTR архейных генов и в кодирующих областях бактериальных генов (6). .

Другой необычной особенностью Sec является то, что он синтезируется на его тРНК, тРНК ^{[Ser] Sec} .тРНК ^{[Ser] Sec} первоначально аминоацилируется серином с помощью серил-тРНК синтетазы, затем сериновый фрагмент модифицируется до промежуточного соединения фосфосерил-тРНК ^{[Ser] Sec} с помощью фосфосерил-тРНК киназы (7), и, наконец, промежуточное соединение преобразована в Sec-тРНК ^{[Ser] Sec} с помощью Sec-синтазы (SecS) у эукариот и архей (8, 9). У эубактерий серил-тРНК ^{[Ser] Sec} является субстратом для SecS, и этот путь синтеза Sec не включает промежуточное соединение (10). Соединение-донор селена для реакции, катализируемой SecS, селенофосфат (SePO ₃ ), синтезируется селенфосфатсинтетазой 2 (SPS2) у млекопитающих (11) и гомологичным белком SelD у прокариот (12).Вставка Sec в белки, как правило, высокоспецифична, но в условиях дефицита Se Cys может находиться в положении Sec, хотя способы генерации этого Cys не установлены (13). Следует также отметить, что специфическая вставка Sec в кодоны UGA Sec может быть нарушена в других условиях в клетках млекопитающих, например, в присутствии аминогликозидного антибиотика G418, где Sec был заменен аргинином путем неправильного считывания и подавления UGA Sec. кодон глутатионпероксидазы 1 (GPx1; 14).

Sec и Cys кодируются разными кодонами и имеют разные биосинтетические механизмы (т.е. Cys не является предшественником Sec и наоборот). Недавно мы сообщили, что коды UGA для Sec и Cys в Euplotes crassus (15). Однако вставка этих двух аминокислот была специфичной и определялась положением кодонов UGA в пределах ORF и доступностью элемента SECIS для взаимодействия с рибосомой.

Наши предыдущие исследования показали, что SecS использует SePO ₃ и O -фосфосерил-тРНК ^{[Ser] Sec} для синтеза Sec (8, 11).Теперь мы сообщаем, что Cys также синтезируется на тРНК ^{[Ser] Sec} in vitro, когда O -фосфосерил-тРНК ^{[Ser] Sec} инкубировали с SecS млекопитающих и тиофосфатом (SPO ₃ ), что de novo Путь биосинтеза Cys также встречается у млекопитающих, что Cys вставляется in vivo вместо Sec в тиоредоксинредуктазе 1 (TR1) и TR3, и что этот процесс регулируется диетическим селеном и доступностью SPO ₃ .

Результаты

Cys синтезируется de Novo на оборудовании Sec.

Недавно открытый путь биосинтеза Cys на тРНК ^{[Ser] Sec} с использованием очищенных ферментов, участвующих в биосинтезе Sec, показан на рис. 1. Во-первых, мы обнаружили, что инкубация O -фосфосерил-тРНК ^{[Ser] Sec} с SPO ₃ и SecS мыши (mSecS) дали Cys, демонстрируя, что SecS может использовать SPO ₃ вместо SePO ₃ (рис. 1 A ). Кроме того, Cys был синтезирован на тРНК ^{[Ser] Sec} , когда O -фосфосерил-тРНК ^{[Ser] Sec} инкубировали с SecS, мышиным SPS2 (mSPS2), Na ₂ S и АТФ (фиг.1 B ), тогда как Cys не производился, если АТФ не вводился (фиг. 1 C ) или если контрольный белок [тиоредоксин (Trx)] заменял SecS в реакции (фиг. 1 F ). Эти данные показывают, что mSPS2 продуцирует активный донор серы из Na ₂ S и АТФ. Реакция, содержащая Caenorhabditis elegans SPS2 (cSPS2) вместо mSPS2, также давала Cys (фиг.1 D ), тогда как селенфосфатсинтетаза Escherichia coli (SelD) показала слабую активность в той же реакции (фиг.1 E ). Эти результаты показывают, что Cys может быть синтезирован de novo на тРНК ^{[Ser] Sec} с использованием компонентов аппарата биосинтеза эукариотического Sec в присутствии неорганического источника серы.

Cys in vitro на тРНК ^{[Ser] Sec} по SecS. Все реакции проводили в анаэробных условиях в присутствии mSecS (если не указано иное) и O -фосфо- ³ H-серил-тРНК ^{[Ser] Sec} . Синтез Cys контролировали добавлением ( A ) SPO ₃ , ( B ) mSPS2, Na ₂ S и АТФ, ( C ) mSPS2 и Na ₂ S, ( D ) cSPS2, Na ₂ S и АТФ, ( E ) SelD, Na ₂ S и АТФ или ( F ) контрольный белок Trx, который включал mSPS2, Na ₂ S и АТФ не проявлял активности в синтезе Cys-тРНК ^{[Ser] Sec} .Перенос стандартов аминокислот показан под каждой панелью. Детали экспериментов приведены в документе Materials and Methods .

Эффективность синтеза Sec и Cys оценивали in vitro при различных концентрациях субстратов и разном времени инкубации (рис. S1 и S2). SePO ₃ был примерно в 5–10 раз более эффективным в генерации Sec, чем SPO ₃ был в генерации Cys (рис. S1, сравните дорожки 2 и 3 с дорожками 7 и 8). При оценке синтеза Sec и Cys с использованием O -фосфо- [ ¹⁴ C] -серил-тРНК ^{[Ser] Sec} в качестве субстрата, генерация Sec была примерно вдвое эффективнее, чем генерация Cys (рис.S2).

Далее мы обнаружили, что mSPS2 гидролизовал АТФ до АМФ, когда в реакционной смеси присутствовал Na ₂ S (рис. 2, дорожка 2) или когда присутствовал H ₂ Se (рис. 2, дорожка 3), поскольку мы показали ранее (8). cSPS2 имел более слабую активность по сравнению с mSPS2 (фиг. 2, дорожка 5), тогда как SelD не обнаруживал активности (фиг. 2, дорожка 8). Поскольку продукт реакции, катализируемой mSPS2, заменяет SPO ₃ в биосинтезе Cys, данные предполагают, что mSPS2 генерировал SPO ₃ .Эффективность mSPS2 с использованием селенида в качестве субстрата была примерно в 50 раз выше, чем при использовании сульфида в качестве субстрата (рис. S3, сравните дорожки 3 и 6).

Сульфид-зависимый гидролиз АТФ селенфосфатсинтетазами (SPS). Реакции гидролиза АТФ проводили с использованием [α- ³² P] АТФ в присутствии или в отсутствие (обозначено NC, отрицательный контроль) либо 5,0 мМ сульфида натрия, либо 0,1 мМ селенида. Были исследованы три SPS: mSPS2, cSPS2 и SelD. В конце инкубационного периода соединения разделяли на пластинах PEI для ТСХ и визуализировали с помощью экрана PhosphorImager.Детали экспериментов приведены в документе Materials and Methods .

Cys вставляется вместо Sec в клетки млекопитающих.

Чтобы проверить, может ли Cys, синтезируемый на тРНК ^{[Ser] Sec} , конкурировать с селеноцистеил-тРНК ^{[Ser] Sec} за вставку в белки, мы метаболически метили клетки NIH 3T3 с помощью ⁷⁵ Se в присутствии или в отсутствие SPO. ₃ . Добавление в среду SPO ₃ ингибировало включение ⁷⁵ Se в селенопротеины (рис.3 A , Верхний , сравните дорожки 1 и 2 с дорожками 3 и 4). Однако анализ вестерн-блоттинга показал, что экспрессия некоторых селенопротеинов, таких как TR1 и GPx4, действительно была повышена, тогда как уровни GPx1 были снижены (фиг. 3 A , Middle , дорожки 3 и 4). Несоответствие между уровнями ⁷⁵ Se-меченного белка и общего белка предполагало, что аминокислота, отличная от Sec, также была вставлена ​​в положения, соответствующие кодонам UGA в TR1 и GPx4.

Cys в TR1 в клетках NIH 3T3 в присутствии SPO ₃ . ( A ) Клетки NIH 3T3 культивировали без (дорожки 1, 2, дубликаты) или с (дорожки 3, 4, дубликаты) 1 мМ SPO ₃ , меченные ⁷⁵ Se, и анализировали с помощью SDS-PAGE на экспрессия селенопротеина. ( Верхний ) ^{75 Показано мечение} Se, ( Центр ) показаны Вестерн-блот-анализы TR1, GPx4 и GPx1, и ( Нижний ) окрашивание белков кумасси синим, используемое в качестве контроля загрузки, является показано.Детали экспериментов приведены в документе Materials and Methods . ( B ) Клетки NIH 3T3 трансфицировали pGFP (контрольный вектор, кодирующий pGFP), pGFP-TR1-His-SECIS (кодирующий pGFP, TR1 с His-меткой на С-конце и элементом SECIS) или pGFP- TR1-His (кодирующий pGFP, TR1 с His-меткой на С-конце, но без элемента SECIS), выращенный либо без (дорожки 1–3), либо с (дорожки 4–6) 1 мМ SPO ₃ , помеченный ⁷⁵ Se и анализировали с помощью SDS-PAGE. ( Верхний ) ^{75 Показано мечение} Se, ( Центр ) показан Вестерн-блот-анализ с использованием антител против TR1 или против His, как указано, и ( Нижний ) окрашивание белков Кумасси синим, использованное в качестве показано управление загрузкой.Детали экспериментов приведены в документе Materials and Methods .

Для идентификации аминокислоты, встроенной в UGA в TR1, этот фермент был выделен сродством из клеток NIH 3T3, выращенных в присутствии или в отсутствие SPO ₃ . Последующий анализ MS / MS показал, что в присутствии SPO ₃ Cys был основным встроенным остатком и что он был в 24 раза более распространенным, чем Sec (таблица 1, Exp. 1). Даже в отсутствие SPO ₃ Cys может быть обнаружен (отношение Sec / Cys равно 9).Кроме того, в клетках NIH 3T3, трансфицированных конструкцией экспрессии TR1, содержащей His-метку, более высокие уровни TR1 продуцировались при добавлении в среду SPO ₃ (фиг. 3 B , Middle , сравните дорожки 2 и 5), тогда как уровни Sec-содержащего TR1 были ниже в обработанных SPO ₃ клетках, чем в необработанном контроле (фиг. 3 B , верхний , сравните дорожки 2 и 5). Полноразмерный TR1 не продуцировался в клетках, трансфицированных конструкцией TR1, лишенной элемента SECIS, как с обработкой SPO ₃ , так и без нее (рис.3 B , см. Дорожки 3 и 6, Средний и Верхний ). Однако усеченный TR1 был получен в этих условиях (фиг. 3 B , см. Дорожки 3 и 6, Middle ). Эти результаты показывают, что для декодирования UGA с помощью Cys требуется элемент SECIS и Cys-тРНК ^{[Ser] Sec} , которые могут быть синтезированы SecS с использованием O -фосфосерил-тРНК ^{[Ser] Sec} и SPO ₃ . .

C-концевых последовательности TR1 и TR3 мыши, выделенных из клеток NIH 3T3 и печени мышей, подвергнутых различным диетам Se *

Cys встречается in vivo в TR у млекопитающих.

Чтобы определить, встроен ли Cys в кодоны UGA в TRs естественных млекопитающих, мы сродно изолировали TR1 и TR3 из печени мышей, получавших различные диеты селеном, и подвергли эти ферменты анализу MS / MS. Cys был обнаружен в образцах, выделенных от мышей, получавших Se-дефицитную (0 ppm Se), Se-достаточную (0,1 ppm Se) и повышенную Se диеты (2,0 ppm Se). Количество Sec и Cys, вставленных в TR1, было примерно одинаковым в рационе с дефицитом Se (таблица 1, опыт 2). Интересно, что при диете, адекватной Se, вставка Cys все еще была очевидна (~ 10% вставки Sec).Однако Cys не был обнаружен в случае диеты с высоким содержанием Se (2,0 ppm Se), что указывает на то, что диетический Se способствует встраиванию Sec при подавлении встраивания Cys в кодоны UGA (Таблица 1, Опыт 2). Митохондриальный TR3 обнаруживает несколько схожие паттерны вставки Cys и Sec в этих диетических условиях (Table 1, Exp. 2). То есть Cys был обнаружен в кодирующем сайте UGA в половине случаев в двух TR в Se-дефицитных диетах, тогда как Cys и Sec были обнаружены в TR1 и TR3 в Se-адекватных диетах и ​​только Sec в Se-обогащенных диетах. .

Обсуждение

Наши исследования устанавливают ранее не описанный путь синтеза и встраивания Cys в белки у млекопитающих. Данные показывают, что в присутствии восстановленной неорганической серы mSPS2 генерирует SPO ₃ , который затем может использоваться SecS для преобразования фосфосерил-тРНК ^{[Ser] Sec} в Cys-тРНК ^{[Ser] Sec} . Эта форма аминоацил-тРНК затем распознается Sec-специфическим фактором элонгации EFsec и вставляет Cys в кодоны UGA зависимым от SECIS образом.Уровни Cys в положениях, обычно занимаемых Sec, зависят от соотношения сульфид / селенид в клетках. Сероводород — сигнальная молекула и «третий газ» (16). SPO ₃ недавно нашел применение для направленного тиофосфорилирования белков (17) и давно известен как токсичная молекула. Уровни сульфида и SPO ₃ у млекопитающих низкие, и их повышенные уровни должны мешать вставке Sec из-за синтеза и вставки Cys в положения Sec. Более того, хотя синтез Sec был намного более эффективным, чем синтез Cys, по оценке in vitro (рис.S1 – S3) в установленном пути биосинтеза Sec (8, 9), важно отметить, что при адекватном количестве селена в рационе мышей около 10% TR1 в печени содержали Cys вместо Sec.

У млекопитающих Cys может возникать в результате синтеза из метионина или транспорта в клетки в виде цистина или самого Cys. Однако уникальный путь биосинтеза Cys, описанный здесь, показывает, что эта аминокислота также может быть синтезирована de novo из серина на тРНК. Этот Cys специфически вставлен в кодоны UGA вместо Sec в TR1 и TR3, и его вставка регулируется диетическим селеном и доступностью сульфида и тиофосфата.Cys — это основная аминокислота, которая вставляется, когда клетки страдают от дефицита селена; однако даже в условиях, достаточных для селена, вставка Cys составляет примерно 10% остатков Sec в TR1. Известно, что замена Cys на Sec в селенопротеинах снижает их активность во много раз, но некоторая активность все еще сохраняется (18–20), предполагая, что вставка Cys может частично компенсировать дефицит селена. С другой стороны, добавление селена в рацион млекопитающих часто считается полезным для их здоровья (21–23).Cys вместо Sec действительно может поставить под угрозу активность TR, но еще предстоит установить, может ли такое снижение активности иметь дополнительные последствия для функции TR, например, как SecTRAP (апоптотический белок, производный тиоредоксинредуктазы с нарушенным содержанием селена; 24). В этом отношении наши результаты, показывающие, что обогащенный селен предотвращает встраивание Cys в селенопротеины, предполагают ранее не описанную роль пищевого селена у млекопитающих: превосходит встраивание Cys в селенопротеины, тем самым максимизируя их активность.

Материалы и методы

Материалы.

Материалы получали следующим образом: клетки NIH 3T3 были приобретены из Американской коллекции типовых культур, [α- ³² P] АТФ (∼800 Ки / ммоль) и ³ H-серин (29,5 Ки / ммоль) от PerkinElmer, Ni-NTA-агароза от Qiagen, ДНК-полимераза Pfu и pBluescript II от Stratagene, вектор pET32b (кодирующий His-tagged Trx) и BL21 (DE3) компетентные клетки от Novagen, рестрикционные ферменты от New England Biolabs, T7 RiboMAX Express Large Scale Система производства РНК от Promega, фильтровальная бумага 3-M от Whatman и пластинки для ТСХ с полиэтиленимином (PEI) и немеченые аминокислоты, селенит натрия, тиофосфат натрия (SPO ₃ ; формула Na ₃ PO ₃ S) и сульфид натрия от Sigma-Aldrich.Все остальные реагенты были коммерческими продуктами высшего качества.

Мыши.

Трехнедельных мышей дикого типа на смешанном фоне (C57BL / 6/129) поместили (после отъема) на дрожжевую диету Torula (Harlan Teklad), которая либо не была дополнена, либо дополнена селенитом натрия. для получения 0 частей на миллион Se, 0,1 частей на миллион Se или 2,0 частей на миллион Se при соблюдении соответствующих диет в течение 6 недель (25). Уход за животными осуществлялся в соответствии с институциональными рекомендациями Национального института здоровья (NIH) под экспертным руководством Джона Денниса [Национальный институт рака (NCI), NIH].

Экспрессия и очистка белков.

Trx, mSecS, O -фосфосерил-тРНК киназа мыши, селенфосфатсинтетаза 2 мыши (mSPS2), в которой Cys заменяет Sec в каталитическом сайте, cSPS2 и SelD были экспрессированы и очищены, как описано (8, 11). Белки диализовали против забуференного трис физиологического раствора в течение 2 часов и хранили при -20 ° C в 50% глицерине перед использованием.

Синтез цис in vitro на тРНК

Синтез, очистка и аминоацилирование тРНК ^{[Ser] Sec} были, как описано ранее (7, 8).Все реакции проводили в анаэробных условиях из-за чувствительности SePO ₃ к кислороду, чтобы поддерживать условия всех реакций как можно ближе к идентичным, после чего проводили хроматографический анализ. Для создания донора серы для реакции биосинтеза Cys 10 мкл смеси, содержащей 20 мМ бикарбоната аммония, pH 7,0, 10 мМ MgCl ₂ , 10 мМ KCl, 5,0 мМ Na ₂ S и по 2 мкг каждого обследовали СПС при наличии или отсутствии 2.5 мМ АТФ инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. Реакции SecS были приготовлены в 10 мкл смесей 20 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 10 мМ MgCl ₂ , 10 мМ KCl, 1,0 мкг рекомбинантного SecS мыши и 5 мкг (∼5 мкл Ки) мкг. O -фосфо- [ ³ H] -серил-тРНК ^{[Ser] Sec} , и добавляли либо 10 мкл 0,5 мМ SPO ₃ , либо 10 мкл реакции SPS, описанной выше. Реакционные смеси инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч, а затем при 75 ° C в течение 5 минут для инактивации фермента, и полученные аминоацил-тРНК анализировали, как описано (8).

Анализ гидролиза АТФ in vitro SPS.

Реакцию гидролиза АТФ проводили в анаэробных условиях в 20 мМ бикарбонате аммония, pH 7,0, 10 мМ KCl, 10 мМ MgCl ₂ , 10 мМ DTT, 0,625 мкМ α- ³² P-ATP, 2,5 мкМ АТФ 0,3 мг / мл каждого исследуемого фермента с 5,0 мМ сульфида натрия или 0,1 мМ селенита натрия или без них. После инкубации при 37 ° C в течение 40 минут 0,5 мкл каждой реакции запускали на пластинах PEI TLC, как описано (8).

Конструирование рекомбинантных векторов TR1.

кДНК мышиного TR1 клонировали, как описано (26). Кодирующую область GFP амплифицировали с помощью ПЦР и вставляли в сайты Nco I и EcoR V вектора pTriEx-4 Hygro (обозначенного pGFP) (фиг. S4 A ). Кодирующую область мышиного TR1 без стоп-кодона амплифицировали с помощью ПЦР и вставляли между сайтами EcoR I и Xho I pGFP. Этот вектор экспрессии TR1 (обозначенный pGFP-TR1-His) содержал GFP на N-конце и 6-His-метку на C-конце, но не имел элемента SECIS (фиг. S4 B ).Наконец, 3′-UTR кДНК TR1 амплифицировали с помощью ПЦР и вставляли в сайт Bsu36 I после последовательности 6-His-метки. Этот вектор экспрессии TR1 (обозначенный pGFP-TR1-His-SECIS) содержал GFP на N-конце, 6-His-метку на C-конце и интактный элемент SECIS в 3′-UTR (фиг. S4 C ). Клонирование и экспрессию рекомбинантных векторов TR1 человека (hTR1) и TR3 мыши (mTR3) проводили точно, как описано (26).

Обработка клеток NIH 3T3 с помощью SPO

клеток NIH 3T3 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS.Для очистки TR1 клетки выращивали в колбах ² емкостью 150 см, обрабатывали 1 мМ SPO ₃ или без него в течение 2 дней и собирали. Для мечения клеток NIH 3T3 с использованием ⁷⁵ Se, клетки NIH 3T3 культивировали в 6-луночных планшетах с 1,0 мМ SPO ₃ или без него в течение 24 часов, 10 мкг Ки / мл ⁷⁵ Se добавляли, клетки инкубировали в течение дополнительных 24 ч, собирали лизаты, анализировали вестерн-блоттингом и визуализировали ⁷⁵ Se-меченных белков с помощью PhosphorImager, как описано (11).

Для экспрессии рекомбинантного TR1 клетки NIH 3T3 трансфицировали pGFP, pGFP-TR1-His-SECIS или pGFP-TR1-His в течение 24 часов в 6-луночных планшетах с использованием липофектамина 2000 в соответствии с инструкциями производителя. Затем трансфицированные клетки делили на две лунки, 1,0 мМ SPO ₃ добавляли в одну лунку каждой и инкубировали в течение 24 часов. К клеткам добавляли десять микрокюри / миллилитр ⁷⁵ Se и инкубировали в течение дополнительных 24 часов. Трансфицированные клетки собирали, лизаты клеток анализировали с помощью вестерн-блоттинга и визуализировали ⁷⁵ Se-меченных белков, как описано (11).

Очистка TR селенопротеинов и жидкостная хроматография (ЖХ) -МС / МС.

TR1 и TR3 подвергали аффинной очистке на колонках 2 ‘, 5’-ADP-сефарозы, очищенные белки восстанавливали с помощью DTT с последующим алкилированием остатков Cys и Sec йодацетамидом, как подробно описано в других источниках (27, 28). Алкилированные белки разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием системы Novex NU-PAGE (Invitrogen) и окрашивали кумасси синим. Полосы белка вырезали и подвергали триптическому расщеплению в геле и анализу ЖХ-МС / МС.Расщепление трипсином в геле обесцвеченных белковых полос проводили в течение 16 ч при 37 ° C. Полученную смесь пептидов экстрагировали из срезов геля и загружали в микрокапилляр из плавленого кремнезема, заполненный гранулами Magic C18AQ (Michrom Bioresources). Жидкостную хроматографию с обращенной фазой выполняли с использованием насоса Agilent 1100 и автоматического пробоотборника Famous (LC Packings). Пептиды элюировали из колонки 60-минутным градиентом ацетонитрила и детектировали с помощью LTQ-Orbitrap XL (Thermo-Fisher Scientific).

Анализ и количественная оценка баз данных.

MS / MS были найдены в объединенной базе данных IPI_Mouse (версия 3.60) (http://www.ebi.ac.uk/IPI/) с использованием алгоритма Sequest (версия 28, Thermo-Fisher Scientific) и 0,5% коэффициент ложного обнаружения. Критерии поиска в базе данных были следующими: два пропущенных расщепления, толерантность по массе предшественника 50 ppm, толерантность к ионам MS / MS фрагментов 0,8 Да и следующие переменные модификации: окисление (M), дезамидирование (NQ) и алкилирование по Cys и разд.Содержание пептидов рассчитывали с использованием высоты моноизотопного пика из усредненного спектра, представляющего весь интересующий хроматографический пик. Перед сравнениями между образцами изменения в экспрессии общего белка и эффективности переваривания корректировали путем нормализации содержания C-концевых пептидов по отношению к другому пептиду mTR, который не наблюдался или, как известно, был модифицирован и идентифицирован с высокой степенью достоверности.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой очных исследований в Центре исследований рака, NCI, NIH (Д.L.H.) и грантами NIH GM061603 и GM065204 (для V.N.G.).

Сноски

• ² Кому может быть адресована корреспонденция. Электронная почта: vgladyshev {at} rics.bwh.harvard.edu или hatfield {at} mail.nih.gov.

• Вклад авторов: X.-M.X., A.A.T., B.A.C., M.-H.Y., R.A.E., R.N., I.S., and S.P.G. проведенное исследование; X.-M.X., A.A.T., B.A.C., M.-H.Y., R.A.E., R.N., I.S., S.P.G., V.N.G. и D.L.H. проанализированные данные; и X.-M.X., A.A.T., B.A.C., M.-H.Y., R.A.E., R.N., I.S., S.P.G., V.N.G. и D.L.H. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1009947107/-/DCSupplemental.

2019 FBS 121 Семестровый тест 1 Вопрос окончательный

ФИНАНСОВОЕ УПРАВЛЕНИЕ 121

СЕМЕСТРНЫЙ ТЕСТ 1

27 августа 2019

ИТОГО: 50 МАРК

ВРЕМЯ НАПИСИ: 100 МИНУТ

Внутренние экзамены Ms M Segoe

Внутренний модератор: Ms E Fouché

Инструкции:

 Ответьте на все вопросы.

 Контрольный лист состоит из 5 страниц (включая титульный лист).

 Пожалуйста, ответьте на ваши вопросы в следующих книгах:

o Вопрос 1 — ПУРПУРНАЯ КНИГА (8 страниц)

o Вопрос 2 — ЗЕЛЕНАЯ КНИГА (4 страницы)

 Округлите ваши окончательные ответы до двух десятичных знаков, кроме случаев, когда дал указание иначе.

 Покажите все свои расчеты в документе, если не указано иное.

 Положение об отказе от ответственности: все имена, персонажи, продукты, места и коммерческие объекты

, упомянутые в этом документе, используются вымышленно, и любое сходство с реальными людьми, живыми

или мертвыми, персонажами, продуктами, местами или коммерческими объектами является чисто случайным .

ФАКУЛЬТЕТ ЭКОНОМИКИ И УПРАВЛЕНИЕ

НАУКИ УПРАВЛЕНИЯ ФИНАНСОВОЕ УПРАВЛЕНИЕ

FBS 121

ВОПРОС 1 — ОТВЕТ В 8 СТРАНИЦЕ ПУРПУРНОЙ КНИГИ (33 ЗНАКА)

Сырье

Обувь выполнена из натуральной кожи. Для каждой обуви требуется кусок кожи длиной 45 см и Ширина 15 см. Кожа, используемая для каждой обуви, должна быть цельной (она не может состоять из кусков). которые сшиты вместе). Кожа пары обуви должна быть вырезана из одного листа кожи. Кожа приобретается стандартными листами шириной 2 метра и длиной 1,5 метра, что стоит R2 100 за лист.После того, как кожаный лист был использован оптимальным образом, никакие обрезки (отходы) не могут быть использовались и должны быть выброшены. Pink Betty всегда оптимально использует кожу.

Подошва, шнурки и строчки, необходимые для каждой обуви, составляют 50 рандов. Клей, используемый для приклеивания подошва к кожаному верху обуви стоит 9 920 рандов в год. После изготовления обуви она отполирована специальной полиролью, которая требуется для изделий из натуральной кожи. Всего 77 банок Полироль по цене 100 рандов за банку использовался для полировки произведенной обуви.

Труда

Рабочие обязаны работать 40 часов в неделю, и им платят 20 рандов за час. Им разрешено сделать часовой перерыв на обед и два дополнительных перерыва на кофе / чай по 30 минут каждый. Чернорабочие не работают по субботам и воскресеньям. Для изготовления одной кожаной обуви у рабочего 60 рабочих. минут с момента размещения кожи на столе до того, как обувь будет сшита и собран. Pink Betty работает 48 недель (с понедельника по пятницу) в год, но рабочие оплачивается 52 недели службы в год (поэтому работникам предоставляется оплачиваемый отпуск продолжительностью четыре недели в год). год).В течение года не было аномальных простоев. Pink Betty назначает достаточное количество руководителей для контролировать процесс изготовления обуви. Один супервайзер может контролировать 3000 обуви в год. и выплачивается 15 000 рандов в месяц.

Прочие производственные затраты

Обувь производится на небольшой фабрике, и фабрикой пользуются разные арендаторы. Вода и электричество и любые другие коммунальные платежи включены в стоимость аренды завода. Аренда для полный год оценки и новых арендных плат не было.Общая арендная плата должна быть разделена в зависимости от площади, занимаемой каждым арендатором. Ежемесячная арендная плата за всю фабрику составляет 27 000 рэндов.

Площадь, используемая Pink Betty, вдвое превышает размер, занимаемое арендатором A, а арендатор B занимает площадь площадь, которая в четыре раза больше площади, занимаемой Арендатором А. На фабрике имеется три коммунальных площадей, которые в сумме в два раза превышают площадь, занимаемую Арендатором Б. Заводская арендная плата общие части разделены между тремя арендаторами поровну. Коммунальные помещения используются как зоны отдыха персонала, кухня и ванные комнаты.Остальные участки фабрики считаются незначительны по сравнению с вышеуказанными занимаемыми площадями.

ВОПРОС 2 — ОТВЕТ НА 4 СТРАНИЦАХ ЗЕЛЕНОЙ КНИГИ (17 ЗНАКОВ)

Этот вопрос состоит из трех независимых частей.

ЧАСТЬ A (4 ЗНАКА)

EDGIRL (PTY) LIMITED

Edgirl (Pty) Limited («Edgirl») — это розничная компания, которая продает одежду и применяет 20% к стоимости (стоимости продаж) для определения их продажной цены. На основании маркетинговых исследований было отмечено, что в среднем Покупатель купит платья, брюки и пару обуви в соотношении 3: 2: 1.Средняя цена за платье, брюки и пара обуви стоят 450, 300 и 370 рандов соответственно. У клиента A есть кредитный лимит R6 960, и желает полностью использовать этот предел.

ТРЕБУЕТСЯ ВОПРОС 2 ЧАСТЬ A

НЕОБХОДИМЫЕ ЗНАКИ а) Сколько платьев покупатель А сможет купить с кредитным лимитом R 960 применяя указанное выше соотношение? 4

ЧАСТЬ B (8,5 МАРКИРОВКИ)

MULTINATIONAL (PTY) LIMITED

MultiNational (Pty) Limited («MultiNational») — компания, поставляющая оборудование для спутникового телевидения. и услуги.За каждого нового клиента клиент платит единовременную плату в размере 2000 рандов, которая включает услуги спутниковой связи, декодера и установки спутниковой антенны. Каждый техник получит 150 рандов за час для установки спутниковых антенн. В среднем на дорогу у каждого техника уходит 30 минут. от одного покупателя к другому. Время в пути от дома / офиса до 1-го клиента и время в пути отведенное от последнего клиента обратно домой / в офис не включается в оплату рабочего времени. В связи с увеличением по требованию клиентов MultiNational назначила десять новых технических специалистов для помощи с установкой спутниковые тарелки.В условиях найма было указано, что MultiNational будет обучать этих специалистов как установить эти спутниковые антенны. Каждому из рабочих разрешается в общей сложности 65 минут в течение день на обед и другие перерывы.

Вы можете предположить, что все десять технических специалистов учатся с одинаковой скоростью.

Техник А потратил следующее количество времени на установку спутниковых антенн на своем самом первом день: Установка: время заняло На 1-ю установку 30 минут На 2-ю установку 27 минут Общее время, затраченное на 3-ю и 4-ю установку 51.3 минуты

Примечание: время предназначено только для установки и не требует времени в пути между ними. клиентов во внимание.

ВОПРОС 2, ЧАСТЬ B ТРЕБУЕТСЯ

НЕОБХОДИМЫЕ ЗНАКИ

a) Рассчитайте применимый процент эффективности (кривая обучения) для техника A в его первый день.

(Процент эффективности = Среднее время n / Среднее время (n / 2)) x 100 Были n = количество установок

1.

б) Предполагая, что техник А продолжает обучение с той же скоростью, подсчитайте, как долго ему потребуется завершить следующие четыре установки (блоки с 5 по 8).3 c) Предполагая, что технические специалисты смогут установить по восемь спутников каждый в первый день. Определить общую стоимость рабочей силы для MultiNational (Pty) Ltd в первый же день? 4 Примечание. Округлите окончательные ответы и расчеты до двух десятичных знаков в этой части. ваш вопрос.

ЧАСТЬ C (4.5 МАРКИРОВКИ)

JEWL (PTY) LIMITED

Jewl (Pty) Limited («Jewl») — компания, занимающаяся продажей ювелирных изделий.