Обшитые: Кубики обшитые плащевкой 100м — Поролон оптом 100х100х100

V. alginolyticus VIO5 обычно имеет однополярный покрытый оболочкой жгутик (рис. 1 A ). К нашему удивлению, мы также наблюдали незащищенный жгутик после визуализации более 30 клеток дикого типа (рис.1 B ), что указывает на редкость, но возможность сборки незащищенных жгутиков у V. alginolyticus . Как и ожидалось, диаметр нити без оболочки значительно меньше диаметра нити с оболочкой, и двигатели также заметно отличаются в оригинальных реконструкциях ячейки (Рис. 1 A и B ). Чтобы лучше выявить разницу между двумя разными типами жгутиков, мы хотели сравнить их бок о бок в одной ячейке. Для этого мы использовали мутант flhG , который, как известно, собирает множественные полярные жгутики (27, 28).Важно отметить, что множественные полярные жгутики обычно образуют большой кластер на одном полюсе клетки; малый диаметр ячейки около полюса является оптимальным для крио-ET анализа с высоким разрешением (рис. 1 C ).

Из ~ 600 томограмм различных бактериальных клеток мы создали ~ 4000 реконструкций двигателей, встроенных в клеточную оболочку. После тщательного сопоставления и усреднения субтомограмм мы получили две различные моторные структуры Vibrio с беспрецедентной детализацией (рис. 1 D и E ) и сравнили эти структуры с моторной структурой из E. coli (рис. 1 ). F ). Моторные структуры имеют несколько общих черт: они аналогичным образом встроены в цитоплазматическую и внешнюю мембраны и имеют кольцо C, кольцо MS, экспортный аппарат и стержень (включая проксимальный стержень и дистальный стержень) и окружающие его кольца L / P. (Инжир.1 G — I ).

Несмотря на эти сходства, двигатели Vibrio демонстрируют несколько заметных отличий от структур E. coli . Например, двигатели Vibrio обладают дополнительной плотностью (окрашенной желтым цветом) вокруг колец L / P (Рис.1 G и H ), которые, вероятно, соответствуют специфическим для Vibrio структурам, таким как H и Т-образные кольца. Мы также наблюдали дополнительные структуры вокруг С-кольца (рис.1 D и G ) в Vibrio , которые отсутствуют в двигателе E. coli . Существует внешняя кольцевая структура, связанная только с покрытым оболочкой жгутиком (рис.1 D и G ), но не с незащищенным жгутиком (рис.1 E и F ), которую мы назвали O кольцо (внешнее мембранное кольцо). Интересно, что присутствие этого кольца коррелирует с поразительным изгибом внешней мембраны на 90 ° и образованием мембранной оболочки, окружающей нить, что позволяет предположить, что уплотнительное кольцо может играть решающую роль в формировании и функционировании оболочки.Напротив, в отсутствие уплотнительного кольца внешняя мембрана четко пересекает L-кольцо в незащищенном жгутике Vibrio (рис.1 E и H ), а также жгутике E. coli (рис. Рис.1 F и I ).

Динамическая природа жгутикового двигателя в оболочке в

Сравнение жгутиковых двигателей в оболочке и без оболочки также предполагает внутреннюю гибкость, на что указывает относительная нечеткость кольца MS и кольца С в оболочке жгутикового двигателя (рис.1 D ). Для дальнейшего изучения этой потенциальной гибкости мы сгенерировали три различных средних класса, а затем выровняли их на основе кольца MS и кольца C (рис. 2 A — C ). Примечательно, что расстояние между цитоплазматической мембраной и внешней мембраной варьировалось от 35 до 29 нм (рис.2 A , C , D и F ), хотя наиболее распространенным классом было 32 нм (рис. 2 B и E ). Интересно, что внешняя мембрана и специфические для Vibrio особенности (T / H / O кольца) все координированно смещают свои позиции, указывая тем самым, что этот комплекс обладает гибкостью, чтобы скользить вдоль дистальной части жгутикового стержня.Напротив, жгутик без оболочки как у Vibrio , так и у E. coli кажется жестким, вероятно, из-за тесного взаимодействия между внешней мембраной и L-кольцом.

Конформационная гибкость жгутиковых двигателей в оболочке в Vibrio . Обшитые в оболочке моторные структуры жгутиков трех различных средних классов показывают различия в расстоянии между CM и OM ( A — C ). Соответствующие схематические модели ( D — F ) показывают связанный с внешней мембраной комплекс, слегка смещающийся вдоль дистального стержня (голубой).

Определение характеристик компонентов Т-образного кольца на месте.

Основные особенности Vibrio сходны как в оболочковых, так и в незащищенных жгутиках (рис. 1). Хотя Т-образное кольцо является основной особенностью Vibrio , необходимой для сборки статора вокруг ротора (19), его структура и состав остаются неопределенными. Для характеристики Т-кольца мы использовали крио-ЭТ для анализа мутантов ∆ motX и ∆ motY на фоне flhG .У мутанта ∆ motY мы обнаружили, что большая часть плотности Т-кольца, расположенной под кольцом P, не видна по сравнению со штаммом дикого типа и мутантом ∆ pomAB , у которого отсутствуют статоры (рис. 1 G ). и H для дикого типа; рис.3 G и H для ∆ pomAB ; рис.3 B и C для ∆ motY ). В клетках с дефектом MotX не наблюдалось значительных различий в Т-кольце (фиг. 3 D — F ).Сравнение ∆ motX и ∆ pomAB жгутиков предполагает, что белок MotX, вероятно, расположен под MotY in situ (рис. 3 E , F , H и I ). Кроме того, плотности, соответствующие уплотнительному кольцу и H-кольцу, остаются видимыми в этих мутантах с Т-кольцом, предполагая, что их образование не зависит от сборки Т-кольца.

Определение характеристик компонентов Т-образного кольца на месте. ( A ) Репрезентативный срез томограммы штамма ∆ motY .( B ) Усредненная структура двигателя ∆ motY . ( C ) Схематическая модель двигателя без MotY. ( D ) Репрезентативный срез томограммы мутанта ∆ motX . ( E ) Усредненная структура двигателя ∆ motX . ( F ) Схематическая модель двигателя без MotX. MotY окрашен в оранжевый цвет. ( G ) Типичный срез томограммы мутанта ∆ pomAB . ( H ) Усредненная структура двигателя ∆ pomAB .( I ) Схематическая модель двигателя без PomA и PomB. Вероятное расположение MotX, которое во многом основано на предыдущем анализе (19), отмечено желтым цветом.

Архитектура

Наши данные показывают, что MotY является основным компонентом Т-образного кольца. Фактически, 13 копий мономера MotY хорошо вписываются в дистальную часть Т-кольца (рис. 4), основываясь на кристаллической структуре MotY и биохимических характеристиках, о которых сообщалось ранее (31).Каждый мономер MotY состоит из двух отдельных доменов. С-концевой домен MotY содержит предполагаемый пептидогликан-связывающий мотив, тогда как N-концевой домен MotY необходим для сборки статора (31). Один мономер может быть помещен в каждую субъединицу Т-кольца. Точно так же мы поместили 13 копий кристаллических структур FlgT в плотности на вершине кольца MotY на основе структурного и функционального анализа (21). Вместе с MotY они образуют уникальную структуру Vibrio вокруг P-кольца.

Архитектура Т-образного кольца Vibrio . ( A ) Структура двигателя Vibrio с различными доменами выделена на 3D-рендеринге поверхности. ( B ) Кристаллические структуры MotY и FlgT были подогнаны к карте Т-кольца и небольшой части Н-кольца, соответственно. ( C ) Наружная мембрана и связанные с ней компоненты жгутиков были удалены, чтобы лучше видеть Т-образное кольцо. ( D ) Вид сверху двигателя Vibrio показывает уплотнительное кольцо, крюк и ОМ.( E ) Другой вид сверху после удаления структур, связанных с OM, показывает CM, крючок и Т-образное кольцо. ( F ) Кристаллические структуры FlgT и MotY хорошо вписываются в Т-образное кольцо.

Статор собирается вокруг Т-образного и С-образного колец.

И MotY, и MotX участвуют в сборке и работе статора. Однако все усредненные структуры из моторов дикого типа и мутантов с Т-кольцом не показали каких-либо очевидных плотностей, которые могли быть внесены статорами. Фактически, структура мотора дикого типа аналогична структуре мотора ∆ pomAB , в котором статорные белки PomA и PomB отсутствуют.Следовательно, у V. alginolyticus или E. coli нет четко определенной структуры статора. Наше наблюдение согласуется с представлением о высокой динамичности статоров у этих видов.

Чтобы исследовать структуру и расположение статоров в V. alginolyticus , мы использовали трехмерную классификацию для анализа плотности вокруг Т-кольца и МС-кольца. В одном из 20 средних значений класса очевидны дополнительные плотности, окружающие Т-кольцо (рис. 5 A ), тогда как большинство средних значений по классам дикого типа и все средние по классам из ∆ pomAB не демонстрируют этих структур, что предполагает дополнительные плотности действительно формируются статорами (рис.5 А ). Чтобы визуализировать дополнительные плотности с большей ясностью, мы создали симметричную структуру комплекса статора (рис. 5 A ), которая затем была отображена на общую структуру двигателя, как показано на рис. 5 B и C .

Общая архитектура жгутикового двигателя Vibrio . ( A ) Один средний класс двигателя дикого типа. Первая панель — это центральная секция. Вторая панель представляет собой разрез Т-образного кольца.Третья панель представляет собой поперечный разрез верхней части цитоплазматической мембраны (ЦМ). Четвертая панель представляет собой соответствующее поперечное сечение третьей панели после 13-кратной симметрии. Показаны вид сбоку ( B ) и вид сверху ( C ) всей конструкции жгутикового двигателя Vibrio .

Общая архитектура

Т-образное кольцо демонстрирует уникальную 13-кратную симметрию как в оболочке, так и без нее, и, вероятно, функционирует как платформа для набора 13 высокодинамичных статоров, собранных вокруг ротора (рис.5 В ). MotY, потенциально прикрепленный к клеточной стенке, может функционировать как каркас для Т-кольца. Периплазматический домен статора, по-видимому, напрямую взаимодействует с MotY (рис. 5 B и C ). По сравнению с хорошо изученным мотором жгутика без оболочки у E. coli (рис.1 F и I ), эти специфические компоненты Vibrio не только отражают сложность жгутика с оболочкой Vibrio (рис. 5 C ), но также обеспечивает прочную основу для установления характерной высокой скорости и устойчивости подвижности Vibrio .

Обсуждение

A

Модель V.alginolyticus flagellum обладает двумя специфическими для Vibrio особенностями в периплазме: Т-кольцом и Н-кольцом. Структура Т-образного кольца является важным компонентом управляемого ионами натрия жгутикового двигателя в дополнение к PomA / B (19). Наш сравнительный анализ моторных структур клеток дикого типа и нескольких мутантов Т-кольца (∆ motX ∆ motY , ∆ motX , ∆ motY ) показал, что T-кольцо имеет 13-кратную симметрию. MotY является основным белком, ответственным за его сборку, поскольку 13 копий MotY хорошо вписываются в Т-кольцо.Напротив, расположение MotX четко не определено, поскольку делеция гена motX не изменила существенно общую форму Т-кольца. Поскольку MotX взаимодействует с MotY, и оба белка важны для сборки статора (19, 42), мы постулируем, что MotX собирается на внешнем крае Т-кольца.

H-образное кольцо, похоже, связано с L-образным кольцом и важно для сборки и работы двигателя. FlgT играет критическую роль в образовании H-кольца, которое, вероятно, состоит из других жгутиковых белков, таких как FlgO и FlgP.Однако общая структура кольца H намного сложнее. Мы предполагаем, что FlgT образует кольцо поверх кольца MotY. Наша модель подтверждается предыдущими биохимическими данными и наблюдением, что мутантные клетки ∆ flgT теряют как Т-, так и Н-кольца (43).

И H, и T-кольца тесно связаны с L / P-кольцами. Они образуют большой комплекс, специфичный для Vibrio , под внешней мембраной. Важно отметить, что мы продемонстрировали, что 13-кратная симметрия Т-колец сохраняется как у штаммов дикого типа, так и у штаммов ∆ pomAB , указывая на то, что симметричные особенности Т-кольца не зависят от статоров.Напротив, 13-кратная симметрия Т-кольца не видна в структуре мотора V. fischeri (25), хотя есть 13 статоров, связанных с мотором V. fischeri (Рис. S1). Одна из возможностей состоит в том, что статоры в V. fischeri более статически локализованы вокруг двигателей, как и в спирохетах (24, 37). Разумно предположить, что в V. alginolyticus 13-кратное симметричное Т-кольцо обеспечивает платформу для набора до 13 статоров динамическим образом, возможно, в ответ на факторы окружающей среды (44).

Сравнение жгутикового двигателя между V. fischeri и V. alginolyticus . ( A ) Центральный участок усредненной структуры (EMD-3156) из 251 моторной частицы в мутанте ∆ pomB из V. fischeri . ( B ) Центральная часть усредненной структуры усредненная моторная структура из 999 моторных частиц в V. alginolyticus ∆ flhG ∆ pomAB . Красные стрелки подчеркивают разницу в уплотнительном кольце.( C ) Поперечное сечение Т-образного кольца, как показано желтой пунктирной линией в A . ( D ) Поперечное сечение Т-образного кольца показывает 13-кратную симметрию Т-образного кольца. Никакой очевидной симметрии не видно в Т-образном кольце конструкции двигателя из V. fischeri ∆ pomB . (Масштабная шкала, 20 нм.)

Действительно, в то время как плотности статора в V. alginolyticus могут быть локализованы за пределами Т-образного кольца в некоторых средних классах, они не наблюдаются в среднем глобальном масштабе, что согласуется с представлением о том, что статоры очень динамичны в цитоплазматической мембране, как было продемонстрировано ранее (9–11).Динамическая природа статоров Vibrio зависит от ионов натрия (7), FliL и других белков (45). Действительно, статоры у разных видов значительно различаются. Максимальное количество статоров в E. coli составляет не менее 11, как измерено с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (5). Новаторское крио-ET исследование жгутикового двигателя Treponema primitia выявило предполагаемое кольцо статора с 16-кратной симметрией (24). Крио-ЭТ исследование B.burgdorferi показал, что 16 статоров встроены в сильно изогнутую цитоплазматическую мембрану спирохет (26, 37). Недавнее исследование жгутикового мотора V. fischeri выявило 13 статоров (25), тогда как H. pylori может иметь 18 статоров вокруг ротора (36).

Внутренняя пластичность жгутиков с оболочкой.

Мы обнаружили неожиданные и значительные различия в расстоянии между кольцом MS и внешним мембраносвязанным комплексом в изображенных нами жгутиковых двигателях V. alginolyticus .Поскольку жгутиковые стержни в клетках дикого типа имеют постоянную длину, мы предполагаем, что наблюдаемое нами изменение длины является результатом способности колец L / P / H / T / O скользить вдоль дистального стержня вместе с соответствующим внешним стержнем. мембрана. Хотя обычно считается, что стержень вращается внутри P и L колец, которые функционируют как втулки в слое PG и внешней мембране, соответственно, ранее не сообщалось, что кольца P / L могут скользить по стержню. Было показано, что несколько P-колец собираются вокруг более длинного стержня; однако P-кольца не были расположены равномерно (46), предполагая, что P-кольцо может по-разному взаимодействовать с нижележащим белковым компонентом FlgG дистального стержня.Фактически, недавнее структурное исследование показало, что дистальный стержень имеет жесткую и гладкую поверхность диаметром около 13 нм и длиной 18 нм (47). Эти общие свойства дистального стержня согласуются с его основной функцией как приводной вал и могут позволить внешнему мембранно-связанному комплексу гибко перемещаться вместе с мембранной оболочкой во время вращения жгутиков. В качестве альтернативы, изменения расстояния могут отражать конструкции, которые фиксируются для каждого двигателя, но отличаются по длине для разных двигателей.

В заключение, наши результаты показывают, что В.Система alginolyticus идеально подходит для изучения архитектуры жгутиков в оболочке in situ. Мы обнаруживаем кольцо внешней мембраны и большое конформационное изменение внешней мембраны, связанное с образованием оболочки и сборкой жгутиков. Мы также обнаружили значительные вариации в расположении мотора относительно жгутика жгутика, что указывает на удивительный уровень конформационной гибкости покрытых оболочкой жгутиков. Кроме того, мы демонстрируем 13-кратную симметрию двигателя, что дает основу для лучшего понимания конкретных взаимодействий ротора и статора в Vibrio .Наконец, наши исследования дают представление об уникальных аспектах покрытых оболочкой жгутиков, которые широко используются многими бактериальными патогенами для установления инфекции и распространения среди людей и других млекопитающих-хозяев.

Материалы и методы

Рост бактерий и подготовка образцов.

Бактериальные штаммы, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. штаммов V. alginolyticus культивировали в течение ночи при 30 ° C на среде VC [0,5% (вес / объем) полипептон, 0,5% (вес / объем) дрожжевой экстракт, 3% (вес / объем) NaCl, 0.4% (мас. / Об.) K ₂ HPO ₄ , 0,2% (мас. / Об.) Глюкозы]. Ночную культуру разводили в 100 раз свежей средой VC и культивировали при 30 ° C при 250 об / мин (Taitec, BioShaker BR-23FH). Через 5 ч клетки собирали, промывали 2 раза и, наконец, разбавляли средой TMN500 (50 мМ Трис · HCl при pH 7,5, 5 мМ глюкоза, 5 мМ MgCl и 500 мМ NaCl) (48). Раствор коллоидного золота (диаметром 10 нм) добавляли к разбавленным образцам Vibrio , чтобы получить 10-кратное разбавление, а затем наносили на только что нагретую решетку из дырявого углерода с дырочками и осаждали на 1 мин.Сетку промокнули фильтровальной бумагой и быстро погрузили в жидкий этан в самодельном плунжерном устройстве, как описано (49).

Штаммы бактерий

Cryo-ET Сбор данных и обработка изображений.

Замороженные гидратированные образцы переносили в электронный микроскоп Polara G2 (FEI), оборудованный автоэмиссионной пушкой на 300 кВ и детектором прямых электронов (Gatan K2 Summit). Изображения наблюдались при увеличении 15 400 раз, что дало 0,25 нм / пиксель.SerialEM (50) использовался для сбора серий наклона при дефокусировке ~ 8 мкм. Общая доза 50 e ^— / Å ² распределяется между 35 изображениями с наклоном, охватывающими углы от -51 ° до + 51 ° с шагом наклона 3 °. Для каждого сбора серии наклона использовался режим фракционирования дозы для создания 8–10 кадров на одно проекционное изображение. Собранные фракционированные по дозе данные сначала обрабатывались программой motioncorr для создания файлов стека с коррекцией дрейфа (51). Файлы стека были выровнены с использованием золотых реперных маркеров и объемов, восстановленных методом взвешенной обратной проекции, с использованием программного обеспечения IMOD (52) для создания томограмм.Всего было получено 1293 томограммы клеток дикого типа и мутантных клеток (таблица 2).

Анализ субтомограмм.

Жгутиковые моторы бактерий определяли вручную с помощью программы i3 (53, 54). Мы выбрали две точки на каждом двигателе: одну точку в области С-образного кольца, а другую — возле крючка жгутика. Затем оценивались ориентация и географические координаты выбранных частиц. Всего 8761 субтомограмма двигателей Vibrio и 1200 субтомограмм E.coli использовали для анализа субтомограмм. Томографический пакет i3 использовался на основе метода «выравнивания по классификации» с отсутствующей компенсацией клина (53, 54) для создания усредненной структуры двигателя, как описано ранее (33, 49).

3D визуализация и моделирование.

Томографические реконструкции были визуализированы с помощью IMOD (52). Программное обеспечение UCSF Chimera использовалось для трехмерной визуализации средних значений субтомограмм и молекулярного моделирования (55).Кристаллические структуры MotY (PDB ID: 2ZF8) и FlgT (PDB ID: 3W1E) из V. alginolyticus были прикреплены к нашим картам плотности с использованием функции «вписаться в карту» в UCSF Chimera.

Благодарности

Мы благодарим Уильяма Марголина за критическое прочтение рукописи перед отправкой. Эта работа была поддержана GM107629 от Национального института общей медицины и AU-1714 от Welch Foundation (J.L.).

Сноски

• Автор: С.Z., S.K., M.H. и J.L. спланировали исследование; S.Z., T.N., B.H., S.K. и J.L. проводили исследования; Т. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; S.Z., S.K., M.H. и J.L. проанализировали данные; и С.З., С.К., М.Х. и Дж.Л. написали статью.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1712489114/-/DCSupplemental.

в оболочке — определение и значение

Преимущества термопар в оболочке

Термопары прочны и быстро реагируют на изменения температуры.В оболочке эти приборы для измерения температуры чрезвычайно устойчивы к вибрации, механическим воздействиям и агрессивным / коррозионным средам. Поскольку термопары в оболочке маленькие и легко изгибаются, они идеально подходят для использования в ограниченных пространствах.

Что такое термопары в оболочке?

Надежные и чувствительные термопары широко используются в различных приложениях и являются недорогим решением для измерения температуры.

Термопара состоит из двух разнородных металлических проволок, соединенных в точке измерения (горячий спай).Другой конец — это контрольная точка (холодный спай), где температура имеет постоянное и известное значение. При повышении температуры в точке измерения разные металлы генерируют разное напряжение (эффект Зеебека). Разница напряжений на холодном спае соответствует температуре горячего спая.

Термопара в оболочке — это тип термопары, в которой провода вставлены и изолированы керамическим компаундом высокой плотности, обычно оксидом магния, а затем заключены в металлическую оболочку.Обычными материалами оболочки являются нержавеющая сталь или сплав 600, но можно использовать любой металл, который можно подвергать холодной обработке.

Преимущества термопар в оболочке

• Устойчивость к вибрации и ударам. Металлическая оболочка и кабель MI защищают проводники от ударов и вибрации, предотвращая поломку и делая термопары в оболочке очень устойчивыми к механическим воздействиям.
• Устойчив к коррозии и агрессивным средам. Нержавеющая сталь 316 обладает хорошей устойчивостью к агрессивным средам, а также парам и дымовым газам в химических средах.Коррозионно-стойкие свойства сплава 600 делают его особенно подходящим для термопар, которым приходится иметь дело с высокими температурами. Он также противостоит растрескиванию и питтингу в средах, содержащих хлор, и коррозии, вызываемой хлористым водородом или аммиаком в водных растворах.
• Маленький и гибкий. Защитная металлическая оболочка позволяет использовать более тонкие проводники и более компактную конструкцию, чем у термопар без оболочки. Диаметр термопар в оболочке может составлять всего 0 мм.25 мм (0,010 ″) без нарушения целостности инструмента. Металлическая оболочка также придает гибкость, что позволяет изгибать без повреждения чувствительного элемента. Таким образом, термопары в оболочке особенно полезны для измерения температуры в небольших помещениях и в узких углах.
• Пределы проводимости и высоких температур. Металлическая оболочка выдерживает очень высокие температуры воздуха: до 850 ° C (1562 ° F) для нержавеющей стали 316 и до 1200 ° C (2192 ° F) для сплава 600 — в зависимости от типа термопары.Оболочка также обеспечивает лучшую теплопроводность, чем термопары без оболочки, тем самым уменьшая время теплового запаздывания и приводя к еще более быстрому отклику.

WIKA производит полные линии термопар в оболочке типа K, типа J, типа N, типа E и типа T. Мы также производим термопары типов R, S и B для широкого диапазона температур и областей применения. Свяжитесь с экспертами WIKA для получения дополнительной информации.

Определение для изучающих английский язык из Словаря учащихся Merriam-Webster

ножны; обшита; обшивка

ножны; обшита; обшивка

Определение SHEATHE учащимся

[+ объект]