U block: uBlock Origin — Chrome Web Store

miR-1296-5p снижает экспрессию ERBB2, подавляя пролиферацию клеток при ERBB2-положительном раке молочной железы | Cancer Cell International

Клинические образцы

В это исследование были включены 114 пациентов с раком молочной железы, набранных из Первой аффилированной больницы Нанкинского медицинского университета с 2013 по 2016 годы.Образцы состояли из 114 тканей рака молочной железы и 30 прилегающих нормальных тканей. Все ткани были гистопатологически подтверждены патологом, который выбрал области опухоли с более высокой плотностью опухолевых клеток, подходящие для выделения РНК и иммуногистохимии (ИГХ). Все образцы были исследованы на патологию и сохранены в жидком азоте для анализа микроРНК. Этическое одобрение исследования было получено Комитетом по этике клинических исследований Нанкинского медицинского университета. Письменное информированное согласие было получено от каждого участника.

Клеточная культура

Линия клеток рака груди человека SK-BR-3 была приобретена в Cell Bank of Shanghai (Шанхай, Китай). Линия клеток рака груди BT-474 была любезно подарена доктором Тяньсун Ся (Первая дочерняя больница Нанкинского медицинского университета). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 или DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Logan, UT, USA) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ .

Анализ двойной люциферазной активности

3′-UTR человеческого ERBB2, содержащий предполагаемый сайт-мишень для miR-1296-5p, был химически синтезирован и вставлен в сайт Xba I, непосредственно ниже гена люциферазы в pGL3-контрольный вектор (Promega, Мэдисон, Висконсин) от Integrated Biotech Solutions Co., Ltd (Шанхай, Китай) соответственно. За 24 часа до трансфекции клетки помещали в 24-луночные планшеты (1,5 × 10 ⁵ клеток / лунку). PGL3-ERBB2-3′-UTR (200 нг) и pRL-TK (80 нг, Promega) трансфицировали в комбинации с 60 пмоль миметиком miR-1296-5p или миметиком miRNA, используя липофектамин 2000 (invitrogen). Люциферазную активность измеряли через 24 часа после трансфекции с использованием двойной системы анализа люциферазного репортера (Promega). Активность люциферазы светлячка нормализовали до активности люциферазы renilla для каждой трансфицированной лунки.Три независимых эксперимента были выполнены в трех повторностях.

Вестерн-блоттинг

Клетки SK-BR-3 или BT-474 высевали в 6-луночные планшеты (6 × 10 ⁵ клеток / лунку). Через семьдесят два часа после трансфекции миметика miR-1296-5p или миметика miRNA клетки собирали и гомогенизировали с буфером для лизиса. Общий белок разделяли электрофорезом в 10% денатурирующем SDS-полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг выполняли, как описано [16]. Первичные антитела к ERBB2, S6, Phospho-S6, бета-актину и GAPDH были приобретены в компании Cell signaling Technology (Danvers, MA).Уровни экспрессии указанных белков были нормализованы до GAPDH или бета-актина.

Количественный ПЦР-анализ в реальном времени на miRNA

Ткани и клетки рака груди выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Фракцию миРНК очищали с использованием набора для выделения миРНК mirVana ™ (Ambion, Остин, Техас). Концентрация и чистота образцов РНК определялись спектроскопически. Ген SYBR и U6 использовали для обнаружения амплификации гена и нормализации каждого образца соответственно.Праймеры обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции были приобретены у RiboBio Co., Ltd (Гуанчжоу, Китай). QRT-PCR выполняли согласно протоколу наборов праймеров. Амплификацию продукта ПЦР определяли по уровню флуоресценции, испускаемой SYBR Green (SYBR® Premix Ex Taq ™ II, TaKaRa), который интеркалировался в двухцепочечную ДНК [17]. Метод ΔCt использовали для анализа экспрессии miRNA в биоптатах. Номер цикла на пороговом уровне флуоресценции (Ct) для каждого образца определяли, а затем вычисляли значение ΔCt.Значение ΔCt представляло собой вычитание значения Ct для miR-1296-5p и значения Ct для U6: ΔCt = Ct (miR-1296-5p) — Ct (U6). Кратность изменения для miRNA по сравнению с каждым контролем рассчитывалась с использованием метода 2 ^{— ΔΔCt} . ПЦР проводили в трех повторностях.

Клоногенный анализ

Клетки SK-BR-3 или BT-474 трансфицировали миметиком miR-1296-5p или миметиком miRNA и высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 1000 клеток / лунку, инкубировали в обычных условиях культивирования. в течение 2 недель, фиксируется и окрашивается кристаллическим фиолетовым.Количество колоний подсчитывали под микроскопом в трех независимых повторах.

Анализ апоптоза

Клетки SK-BR-3 помещали в 6-луночные планшеты (6 × 10 ⁵ клеток / лунку). Через сорок восемь часов после трансфекции миметика miR-1296-5p или миметика miRNA использовали проточную цитометрию для обнаружения апоптоза трансфицированных клеток SK-BR-3 путем определения относительного количества аннексина V-FITC-положительного и йодида пропидия. (ПИ) -отрицательные клетки. Аннексин V-FITC и PI были приобретены у BD biosciences (Сан-Хосе, Калифорния).

Анализ активации RhoA и Rac1

Для анализов активации RhoA и Rac1 клетки рака молочной железы помещали в чашки диаметром 35 мм и трансфицировали миметиком miR-1296-5p или миметиком miRNA. Затем эксперименты проводили в соответствии с протоколом производителя (Cytoskeleton Inc., Денвер, Колорадо, США).

Анализ чувствительности к лекарствам in vitro

Клетки рака груди человека SK-BR-3 или BT-474 помещали в чашки диаметром 35 мм (6 × 10 ⁵ клеток / чашку), 100 нмоль / л miR-1296- 5p-миметик или 100 нмоль / л миметический контроль miRNA трансфицировали в клетки SK-BR-3, используя липофектамин 2000 (Invitrogen, Long Island, NY, USA).Миметик miR-1296-5p, миметик miRNA был химически синтезирован Shanghai GenePharma Company (Шанхай, Китай). Через 24 часа после трансфекции клетки высевали в 96-луночные планшеты (5 × 10 ³ клеток / лунку). Через 48 часов после обработки лекарством жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (MTT, Beyotime Biotechnology, Наньтун, Китай). Оптическую плотность при 490 нм каждой лунки считывали на спектрофотометре. Концентрацию, при которой лекарственные средства вызывали 50% ингибирование роста (IC50), оценивали по кривой относительной выживаемости.Три независимых эксперимента были выполнены в четырех повторностях.

Статистический анализ

Каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз. Числовые данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Разницу между средними значениями анализировали с помощью t-критерия Стьюдента. Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения SPSS 13.0 (Чикаго, Иллинойс). Различия считались значимыми, когда p <0,05.

The Salt Lake Herald из Солт-Лейк-Сити, штат Юта, 26 мая 1893 г. · Стр. 4

FT r II 4 THE SALT IABJE HEHALIK 20 мая 1893 SALT LAKE HERALD SALT LAKE CITy UTAH BY THE HERALD PUBLISHING CO-ДИРЕКТОРЫ JI O CHAMBERS Президент Hmmn J QBAKT Вице-президент TL WILLIAMS SMK AWL Дж. Gncacs CCLLIXS SIMON AMDERGEA HonACE G VUITSET PnAMLIN S RICHARDS УИЛЬЯМ ХАЙД Редактор ЧАРЛЬЗ ВЕЛЛООЙ БЫСТРЫЙ РЕДАКТОР THE DAILY HEKALD Издается каждое утро понедельника, принимается в TUB HERALD BlOTsk угол Западного храма и Первого Южного Италии Саллис Сити Дэйлис. I месяцев 500 Dally в месяц 100 SemiAVoeldy в год 300 Semi WeelUy шесть месяцев 150 Воскресенье в год 250 Bundajsix месяцев 150 подписок LL, оплачиваемых строго заранее. Сообщения ALT должны быть адресованы I Tin HERALD Salt Lake City, Юта. ПОДПИСЧИКИ будут передавать информацию путем пересылки информации. к этому П бен их бумаги не вовремя ритуали Они помогут определить причину своих писем EBBSCBIBERS rcmoi s от одного места к другому, и желаемые документы всегда должны давать мне хорошую форму j & gt; Настоящий адрес Сообщения не возвращены 1 Анонимное сообщение не было замечено THE HEHAU оставляет за собой право добавлять имя автора к любому сообщению и не принимает рукописи с обещанием Trithold the bame от любого лица, упомянутого в сообщении j Inc. HERAXD Ls в продаже на основных газетных киосках и во всех утренних пассажирских поездах I, отправляющихся из Солт-Лейк-Сити Заказы на доставку по городу j либо по месту жительства, либо по месту работы j 1 могут быть отправлены по почте или по телефону j 1 ИЗДАТЕЛЬСКАЯ КОМПАНИЯ HERALD IHC nROW LEE Business Manager SJE gUN DAY HERALD lfAY 2STH Местное местное общество Fercisn LI fc Развлечения Горная недвижимость Спорт на открытом воздухе Общие 3oivs СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ CAMILLE u1JI1IARIOX I История самого известного астронома наших дней интересует многих лидеров биографии дана дуга, и статья освещена двумя двойными вырезками столбцов Cl, показывающими обсерваторию ФЛАММАЙОСС I и его исследование arusic OF WAR HAYS I Генерал HORATIO C KIXG пишет о солдатских песнях и о том, как они пели в последней Америке, войне с воспоминаниями о Смелом солдате, Анни I, Девушка Лори, оставленная позади меня и т. д. В этой 1 статье рассказывается о том, как как убийство ЛИНКОЛЬНА, совершенное УИЛКЗОМ БУТОМ, было воспринято той частью союзной армии, с которой писатель должен был столкнуться. типичная I королевская домохозяйка и мать с своего рода расписанием ее повседневных занятий I и кое-что о ее привычках и вкусах Дан ее портрет, а также группа, состоящая из кайскринского наследного принца и его младших братьев-принцев вместе с C-изображением Великая герцогиня Исидская, в которую был влюблен император Вильгельм, но на которой ему было запрещено жениться. LA IrS TEXXIS SEASOX Любители большого тенниса найдут в этой статье некоторые занимательные подробности. s чеканки событий, тропиков сезона и конкурсов, которые будут проводиться в Чикаго и других местах. Несколько иллюстраций украшают текст ЗОЛОТОЕ БЛЮДА. Миссис МакГуинк рассказывает историю чудесного открытия двух девушек из Инту, которые после многих лет экспериментов обнаружили секрет украшения фарфора таким образом. чтобы он выглядел в точности как сплошное золото, и которые тайные химики и алхимики пытались открыть для себя EARXIXG ЕГО ПУТЬ преподобный доктор SC БАРТЛЕТ, бывший президент Дартмутского колледжа, в очень аккуратном наброске рассказывает, как некоторые мальчики получают образование E в колледже и как это сложно Достижимо с помощью многих ПРЕДОСТАВИТЬ 1XD КИТАЙСКОГО ВИКЕРАЯ Это письмо указывает на лагерь между C Gen & lt; Рант и великий китайский вице-король ЛИ БУСГ ЧАКГ связали их и их детей-детей проповедью дружбы, и как представители Китая украшают могилу генералов в каждый поминальный день. Он сопровождается портретами китайского вице-короля и китайского министра в Вашингтоне. cC OrAL MEMORIALS Интересная статья — это статья FRAMI POPE HDMPIIHEY, где все статуи и памятники семьи королевы Викториас в Балморале Шотландии находятся в пирамидах из камней и памятников с анекдотами принца Кусорта, принцессы Алисы и других членов королевской семьи E Фотографии статуи принца АЛЬБЕРТА обелиск АЛЬБЕРТА крест в память о кафедре принцессы АЛИСЫ принцу ЛЕО СЛОЖИТЕ пирамиду из камней АЛЬБЕРТА и юбилейную статую ВИКТОРИИ HAGrXSECKS ADVENTURES BAYMOXD BLATinvAYi завершает серию статей о дрессировке диких животных некоторыми захватывающими анекдотами о HAUL HAGENBLCKS 4 и змей C. Среди историй есть рассказ о битве I между h alfadozen великие аллигаторы, проиллюстрированные разрезом в две колонки L QVEEA OF THE POOL Еще одна интересная легенда о стране Конго C, написанная ГЕНРИ СТАНЛЕТОМ, автором книги I I & gt; Ia Самая темная Африка и т. Д. Эти истории, хотя и появляются последовательно, не связаны ни с одной другой, но каждая из них полностью завершена In itelf С двухстрочными изображениями II TEA GOT NS AXD TRAVELING WEAR ИЗАБЕЛЬ ДЮКСДАС рассказывает читательницам C THE HERALD, что нового эпического периода в I чайные халаты и о некоторых свежих и превосходных импортных товарах для лидеров общества. За этим следует подробная статья Lan C GAUFT COMPXOK, дающая практические наблюдения опытного путешественника Icnccd о том, что женщины должны взять с собой в Чикаго, с описанием некоторых элегантных костюмов. и дает несколько советов и указаний, которые будут полезны для всех женских 7 туров. Две статьи обильно иллюстрированы. C THE HOUSEHOLD 1 IC Lhcre будет симпозиумом статей МАРТЫ СТКОЛЛОХ УИЛЬЯМС МАРГАРЕТ КОМПТОН и ЭММЫ И ВЛАГАН о том, как сохранить цвета дома. аккуратное платье и лучший способ его стирки на украшениях для окон и о том, как приготовить клубнику для стола Lri CC Every Testimonial In name Hoods Сарсапарилла строго верна и выдержит самое тщательное расследование. Независимо от того, откуда она может быть, она столь же надежна и заслуживает вашего доверия, как если бы она исходила от вас. Самый уважаемый сосед. Вы когда-нибудь пробовали это прекрасное лекарство. Для общего семейного катарсиса мы с уверенностью рекомендуем вытяжки Таблетки. Они должны быть в каждом домашнем сундуке. 131 Покровительствуйте торговле гомосексуалистами, как это делает Чикагский ликеро-водочный завод & gt; Это Организация лиг Кили, но один шаг в прогрессе территории. Они существуют по всей стране, и каждый член гордится своим членством. Приходите и посмотрите, как мальчики это делают. 16 мая Union Pacific будет продавать билеты в восточные районы по следующим сниженным ценам. Первый второй класс до Денвера и Пуэбло 513 00 до реки Миссури 31 15 25 CO до Сент-Луиса 37 65 31 50 ro Чикаго ilfi5 35 50 I Самый короткий и быстрый линия City i, касса, 201 Main street & gt; Печень 31aUe a Well 3lan I Есть ли у вас желчный запор или проблемы с желтухой, больная головная боль, неприятный привкус во рту, неприятный привкус во рту, затхлый язык, диспепсия, рассеивание, горячая сухая боль в коже в спине и между плечами, озноб, лихорадка и т. Д., Если у вас есть какие-либо из этих симптомов ваша печень вышла из строя, и ваша кровь медленно отравляется, потому что ваша печень не работает должным образом. Herbino будет евро при любом заболевании печени, желудка или кишечника. Он не имеет себе равных, как лекарство для печени. Цена 75 центов Бесплатная пробная бутылка в ZCM Idrug Department i ложь. Уверена, что застраховываете. И когда вы застраховываете, попросите Her J Grant Co разместить вас в знаменитой Пенсильвании, если I II. Жалобы на желудок, кишечник, печень и головную боль используют AYERS CATHARTIC PILLS. Они утомляют чисто растительное сахарное покрытие, быстро растворяются и легко принимают j & gt; 4 I Каждая доза V 1 4 t & lt; I Эффективный CC T I Театр в Солт-Лейк-Сити C CHAS a BURTON 1 Менеджер Субботний вечер, 27 мая 230 i1gersll TILE Хоровое общество S В Гайднсе Большая оратория Сотворение в сопровождении l & gt; y Pedersens Concert Orchestra СОЛИСТЫСопрано Анна Колберн Пламмер Миссис Джон Гриу Мисс Дженни Уинстон Тенор Мистер Берт Хэвенс Баесо Гораций Кнслан младший профессор Бван Стивенс дирижер Профессор Антон Педерен лидер 01 оркестр Проф 7ho Rttdcliffe органист Популярная распродажа JO от 5 до 25 минут 21 Можно приобрести обменный билет для членов Iroin СЛЕДУЮЩЕЕ ПРИВЛЕЧЕНИЕ Грандиозное производство THE SEA OF ICE Вечер вторника, 30 мая Цены SltO TIC Me one 25 Начало единственного места Суббота, 7 мая Gl24fpr a lJa I 1 I = r oil 2 S Jt nexl CVlfrJ 14Qi1I IRO WE НЕДЕЛЯ ЧЕТВЕРГА 25 МАЯ Идеальная оперная труппа в Gilbert Sullivans Opera 10LANTHE или TI1U LEER и конгресс ковбоев и девушек FJCIU в Curio Hall Вход в ooi11ll ODBra llollo P Commercial Stsnht GRAND FII NK MocnosManager Все участники этой недели Baba The Gcorgcous Зрелищные марши и балет Grand II Новая сцена трансформации i 40FORTY PEOPLE40 I НА СЦЕНЕ Катушка на своем собственном специальном поезде Великий Европейская и американская консолидация ГНЕЗДА Грандиозные международные выставки союзников CIUCUS MJBNAGBK1E HIPP00I10JIE И AQUAHIUM C ВЫСТАВЛЯЮТСЯ В СОЛЬНОМ ОЗЕРЕ 3031 МАЙ: 150 всемирно известных метеоров Все метеоры Монстры зверинца из редких диких зверей, никогда ранее не встречавшихся в Америке. новые возможности ARTISTIC PEERLESS PUKE Подробности смотрите в различных рекламных носителях Две грандиозные выставки ежедневно Двери открываются в 19:00 и в 19:00 117 Fb 5 EG ODoNSEU CO NiPPLfc I ODONNBLL NEPPLE 11 Генеральные гробовщики и бальзамировщики 57 E Second South Tel 5SO I SALT LAKE CITY C2T6asTrafn3 Copyrte Design И вся патентная деятельность велась за УМЕРЕННУЮ СТОИМОСТЬ Информация и советы, данные изобретателям за плату Addren PRESS CLAMS CO OHr WDUEUfl Lima EtaZ Attorney f O Box as Wjwnisraios DO tyTThls Компания Управляется комбинацией крупнейших и самых популярных газет в Соединенных Штатах. цель cprcJI защитить Дже их oHb acrlliera aeslnat onscrupulona ana Некомпетентные скрытые агенты И каждая печатная реклама на бумаге гарантирует плодотворную реакцию, поскольку мы подходим к каждому КАЖДОМУ каждый раз. чем хорошая статья где-нибудь еще Кому бы не подошла такая комбинация подходящих качеств? Такой наш бизнес подходит для публики, и мы поддерживаем его круглый год. Нам нравится, и мы не предлагаем менять наш бизнес. Публике Солт-Лейк-Сити это нравится и Шествие покупателей идет к нашему магазину за своими летними костюмами ОДНА ЦЕНА p ГАРДНЕР, 141 ГЛАВНАЯ УЛИЦА a ICJ r БОЛЬШОЙ r 1 ДОМ ОДЕЖДЫ И C Товары общего назначения T Ткань и качество изготовления в позднем стиле В приведенной выше линии Jin portanl см. полный ассортимент теперь отключено z C M0LI I & lt; dI w = II II II 3Icnfs Youths Boys and Chil Wcglisrce и классические рубашки Нижнее белье drcns подходит для всех размеров и классов lIens Брюки и жилеты Ночные халаты для мальчиков Изысканные и вкусные штаны Штаны до колен и т. д. Balbriggaii Fancy and Black Half-Hose Мужские летние шорты и жилеты Платки Платки Платье 3l ns Альпака и льняные тряпки & gt; и Fancy Bows специальность 3Ieus White и Fancy Vestf Подтяжки Перчатки для одежды и вождения и т. д. Соломенные шляпы для мужчин и / или мальчиков Valises всех размеров I цены и W Дети всех размеров и цветов YaBses цвета Необычные кепки и фетровые шляпы Summer I Brine your Husbands Мальчики и талии для маленьких детей Дети ITG WEBBER Суперинтендант FR GO I TO EN J JENKINS НОВЫЙ ХРАМ МУЗЫКИ C w Самое дешевое место на земле, чтобы купить прекрасное PIANO или ORGAN первого класса Самый большой и единственный полный запас на западе Double Z1rm I 73 Vest Second South St oIe jJuuut tJttJLL tf 207 South West Temple St f James erKteman KJr Co Q Преемники ДЭВИДА ДЖЕЙМСА CO I PLUlIBERS TINNERS Паровые и газовые установщики Мы также предлагаем полную линейку Gem и Peninsular Stove and Range3 Бензиновые и масляные печи Столовая посуда Гранит Железная посуда и товары для дома 62 1MAIN STREET ELIAS MORRIS 1 Прибыли новые каминные доски C Позвоните и посмотрите дизайн штрафов в каминных полах И ПОКРЫТИЕ ВСЕХ ОТТЕНКОВ IK TILES Выставочные залы на 21 и 23 WEST SOUTH TEM PLE STREET Тяжелые времена, когда вы цените такой дом, как Наш C l & gt; 4 e C T5 I VJ oj У нас есть все, что вы хотите, от ДОМАШНЕЙ МЕБЕЛИ. 1 фут Только Installmont IIOIIO в городе C 00 FREED FURNITURE CARPET I 1 C COMPANY C ITos 82 84 38 88 40 и 42 East Third South Street jj I & lt; frr 1 II и I Важные вопросы I Удивительно, как даже люди и газеты, утверждающие, что принадлежат к одной и той же компании II, будут расходиться по жизненно важным вопросам The Mail and Express of New York позиционируется как подлинно республиканская газета. Первый считает, что перспективы партии блестящие для футуро и что она демонстрирует жизненную силу и энтузиазм, которые весьма заметны после национального отпора. Второй предсказывает гибель партии, если она будет настойчиво придерживаться определенного курса, и предвещает рождение. новой партии, которая введет бесплатную серебряную чеканку и выплату дохода со случайной защитой, виртуальный отказ от республиканских доктрин Ноябрь странно сказать, что республиканский орган Нью-Йорка ожидает триумфа партии в новой кампании, потому что она пойдет вместе со своими чемпионами плечом к плечу против свободной торговли свободным серебром и нечестной валютой. Тем не менее, в якобы республиканской газете Солт-Лейк-Сити говорится, что это бесплатное серебро и валюта титул партии как та самая слабость, которая может привести к ее полному поражению, если она продолжит свое существование. Иил и Е заявляют, что это будет выбранной основой для следующей кампании, поскольку республиканцы обеспокоены и готовы к прямому суду. силы перед народом по этим вопросам m 1896 г. Но The Tribune уверена, что если партия будет стоять на этом основании, она погибнет, и ее место займет новая партия. Эти два защитника одной и той же партии могут осветить эту разницу. между собой Демократическая партия готова поддерживать позицию, которую она заняла в Чикаго по жизненно важным вопросам времени, и не боится результата. Эта партия присутствовала, хотя и не в качестве скорбящих, на похоронах предшественников республиканской партии и будет присутствовать на ней. вовремя, чтобы помочь в его похоронах & lt; uu Tlieii anil Now Сразу после освящения Храма в этом городе Provo Enquiier произнес несколько предложений, которые понравились тем, кто их читал, и вселили надежду на то, что он собирается реформировать в некоторых важных деталях. Вот одно из них. The Enquirer надеется, что лучшее чувство будет результатом того, что многие тысячи Святых Латтерды войдут в Храм на общем уровне братства, что отныне религия будет одним, а политика — другим, и что не будет никакого смешения или смешения двух, которые Мы заложили в будущее Ссылка В нескольких случаях было очевидно, что это предложение предназначалось для руководства другим людям. Практика, которую ты проповедуешь, не кажется правилом, регулирующим Энгуикр. Он только что сформулировал следующее в качестве комментария к замечаниям двух северных газет. о смешении религии и политики. Существует так много учений церкви, которые согласуются с республиканством или, может быть, это было бы Лучше опровергнуть это утверждение и сказать, что многие принципы республиканской партии согласны с мормонизмом. Движение, чтобы бросать свои насмешки и насмешки и делать несправедливые выводы из глупых замечаний. Среди лучших людей всех партий здесь есть сильное желание полностью отказаться от оскорбительного различия, которое произошло между нашими гражданами Мормона и язычников. быть сделано в отношении политических вопросов. Гармония, которая необходима для нашего прогресса в Юте, не может быть достигнута до тех пор, пока вопрос о религии человека не будет исключен из партийных соображений и требований к любой должности. с его высказываниями сейчас. Хорошо не проявлять чрезмерного усердия, даже если кто-то новичок и свеж в каком-либо деле. Если эта газета хочет показать что он действительно республиканец в своей политике, он может сделать это, защищая истинно республиканские доктрины. Во всяком случае, он только нанесет ущерб этому делу и себе, пытаясь связать свою церковь и свою политику вместе, чтобы они выглядели как одно предупреждение для девочек. Чикагские газеты проливают свет на темные места выставочного центра Worlds Fair City, который во многих отношениях достаточно грязен, но во многих отношениях предприимчив, прогрессивен и достоин во многих других. Мы не собираемся повторять сказанное о домах, которые кажутся респектабельными частными лицами. отели и общежития, но которые являются пристанищами для беззакония, мерзкими ловушками для невинных, и которые управляются самым худшим классом женщин в мире, существа, которые потворствуют человеческим порокам, предавая свой пол. Но есть что-то, связанное с этой отвратительной темой, что она необходимо разоблачить, и каждый респектабельный журнал в стране должен внести свой вклад в предупреждение неискушенных против зла. Это согласованная попытка прокуратуры. адская схема, чтобы заманить в ловушку добродетельных молодых людей к их гибели. Распространяются рекламные объявления в различных формах, обещающие легкое и оплачиваемое трудоустройство молодым девушкам. Они достаточно справедливы по форме, язык не может быть исключен, и они рассчитаны на то, чтобы обмануть неосторожных и ослепить Подозрения обычных читателей. Они действительно созданы для того, чтобы соблазнить невинных 10 мест, где они станут легкой добычей развратных негодяев и приведут или заставят жить позором и позором. Худшая часть бизнеса — это то, что им занимаются женщины. манера шитья или какое-то другое надлежащее занятие, эти женщины-сводники помогают женщинам-хранительницам этих притонов беззакония в дьявольской торговле, которую они ведут. В словаре нет слов, достаточно сильных, чтобы осудить их мерзость или представить всю глубину их порочности. Говорят, что есть нечто большее, чем f & lt; В некоторых городах мне обычно не хватает помощи по дому, потому что очень много девушек стекаются в Чикаго в надежде получить высокую заработную плату в связи со спросом на женщин-рабочих. Вот где большая часть опасности, которую привлекают такие предложения. Я, как видно из этих рекламных объявлений, и я вдали от их естественных советников и защитников, многие из этих девушек, вероятно, будут приведены к их уничтожению C Полицейские власти города будут заняты сохранением павлина и заботой о повседневных делах дело, которое будет навязано тогда.Это будет время жатвы для злодеев! Не только воровские сапоги, управляющие бунко, уверены, что люди и мошенники, как правило, будут делать большую работу, но и завсегдатаи гнусных домов и гарпии, которые потворствуют их злу, найдут новые и более легкие возможности для достижения их основных целей. Предупреждение должно быть озвучено за границей, и ни одна молодая женщина не должна заниматься какой-либо работой в большом городе у озера, пока в каждом случае был тщательно исследован и доказал свою респектабельность. Напрасная попытка Тильбуну не нравятся комментарии в газетах, выходящих за пределы территории, о его стремлении возродить панику по поводу многоженства. I Ожидается, что Ву не упомянул об их разоблачениях наших современников. Схема, чтобы доставить ему удовольствие В его наблюдениях, что их критика доставляет удовольствие ИСТОРИЯ, есть доля правды, что-то в замечании Трибьюн. Море утешает то, что другие газеты способны понять мотивы, которые побудили к попыткам реанимировать просроченные проблемы и провал которые обязательно придут на него The Tribune, естественно, демонстрирует доказательства крайнего беспокойства по этому поводу. Наш обеспокоенный сосед возражает в своей привычной логической и убедительной манере. То есть он приписывает недостойные мотивы газетам, которые борются с его усилиями. они за пределами мерзавцев, к тому же все это очень мощно для аргументации, не так ли? Это метод Tribune. Что касается редактора журнала Denver JVeics, он объявляет, что он претендует на высокий пост, и когда придет время, он хочет, чтобы каждый мормон голосовал в Колорадо, и торжествующе добавляет. Я сочувствую бедной Юте II. Но если все это воображаемое стремление к голосованию мормонов на посту и тому подобное было правдой и разумно, то какое отношение это имеет к чепухе «Трибуны», посвященной антиполигамии, и комментариям, сделанным по этому поводу внешними негодяями из новостей. Я статьи Ни чудесные аргументы, ни избранные эпитеты нашего приятного соседа не подтверждают его аргументов или я опровергаю то, что приводили его оппоненты. Возможно, лучший ответ, который можно дать на его нападки на эти статьи, — это его собственные слова в той же статье, которая содержит нападение. Они такие. Нечестные люди в моде приписывать подлый мотив людям, которые поступают вопреки их идеям. иллюзорности, которыми мог бы воспользоваться Трибун и принесенные им жертвы, смехотворны для всех в этих регионах и будут по достоинству оценены в других местах. имел шанс может быть расценен как предложение Но мы не думаем, что они добьются успеха, и поэтому мы можем искать больше злых слов и ругательств против государственности. Однако действительно приятно быть уверенным, что они не будут учитываться и что время прошло, когда они могли достичь своей намеченной цели как дома, так и за границей. И почему Cheyenne Sun стал строго республиканским журналом и отвергает идею о том, что он принимает во внимание любые попытки построить стену между Ютой и государством. Это то, что нужно Солнцу. по этому поводу The Evanston Register допустила ошибку, заявив, что Sun одобрила сенсационную историю Salt Lake Tribune о полигамии в Вайоминге. вид, но явно дискредитирующий тот же самый Регистр говорит, что существует несколько отдельных случаев, но они принадлежат исключительно к классу, чьи пески жизни почти исчерпали себя. Теперь это будет для того, чтобы в статью, не одобренную для включения шайеннов, светило среди внешних негодяев, которые не согласны с его тщетными попытками развить старую и устаревшую сенсацию. ЮЖНАЯ КАРОЛИНА будет Меккой пьющих спиртных напитков в рамках новой диспансерной системы, которая требует, чтобы государство занималось всеми опьяняющими вещами, которые продаются Девять десятых годов прошлого века. Согласно имеющимся данным, объем проданного виски на 20-40% ниже уровня доказательности, не считая того, что он засахарен, обработан и окрашен. Теперь будет честная мера и чистая статья. не менее 500000 ЗНАМЕНИТЫЙ клуб Сорозиса в Нью-Йорке, в который входят многие известные женщины-члены, находится в тяжелом положении из-за того, что у кого-то есть дары Уничтожьте секреты исполнительной сессии На недавней встрече трое кандидатов были занесены в черный список из-за недоброжелательности клики, и теперь офицеры клуба осуждают это явное. Обещан большой скандал на Королевском сидо Берингси. Трибунал утверждает, что если печать является домашним животным, то Соединенные Штаты должны поставить на него клеймо, чтобы доказать, что его право собственности на крупный рогатый скот должно быть помечено американскими законами. Если сэр Сибкес приедет в эту страну, он должен быть немедленно проверен на предмет британцев. торговая марка Ia БЫЛО ПОЖАЛУЙШЕ, что решение судьи ЛАНАНСА передать ТЕОРЕ ТОМАСУ из руководства музыкальным отделением Всемирной ярмарки до сих пор дало результаты, поэтому ТОМАС остается и исполняет музыку, в то время как комиссионеры должны сидеть сложа руки и сидеть сложа руки. осудить его поведение и пересмотреть его программы. СУДЬЯ ИДЖАКДМБЕ окружного суда Нью-Йорка постановил, что пункт dejorta tjon китайского закона GEARY, хотя и остается неизменным. решение не требует самообеспечения, молчание относительно того, как и кем оно должно быть выполнено. Эта точка зрения на дело, несомненно, будет поддержана миссионерами. Общее собрание PBESBYTERIAN приняло резолюцию, объявляющую логовище миров только складом, закрепленным за государством. Согласно этой точке зрения, можно считать, что они подпадают под действие закона восьмого четвертого и закрываются в 5 часов во второй половине дня. НАСТОЯЩИЕ пенсионные расходы требуют ежегодного налога в размере около 3 на человека на каждого человека в Соединенных Штатах. закон может быть полностью соблюден, и сумма, ежегодно выплачиваемая на пенсии, может быть снижена более чем на 525030COO & gt; & lt; ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ, что ограбления поездов возле Сент-Луиса совершаются только в поездках за границу. С чикагскими дорогами, вероятно, было бы наоборот, негодяи ожидали чего-нибудь получить. СОВЕТ менеджеров Всемирной ярмарки и Пресвитерианской генеральной ассамблеи в Вашингтоне. Я выступаю в гонке за синюю ленту негармоничного чувства. ГЕНЕРАЛЬНЫЙ АДВОКАТ Олки выложил стопку фишек и начал игру в Чикаго в связи с воскресным открытием ярмарки. Он предлагает судебный запрет. В этом году холера возникнет в нашей стране, а не в Европе. Никаких признаков холеры за границей не появилось. ПРИНЦЕССА ИЛАЛИ сейчас находится в Нью-Йорке и была передана в нежную милость WARD MCALISTER, а остальные 399 ДОН ДИКИНСОН снова получили работу. в назначении достопочтенного В. Ф. КУИНБИ из Мичигана министром в Нидерландах. САМЫЙ БОЛЬШОЙ человек в штате Калифорния сегодня — полковник ПОМПАДУР Ж. Кон БЕТТ. ЧИКАГО МОЖЕТ развлечь инфанту. только дав билеты на шоу. Ронас изучает политику без учителя в Иэндоме, Грейт-Фоллз. Республиканская. О сидячей болезни так же правильно говорят, как и об одной давно существующей Бостонской стенограмме. праздность, когда мужчина слишком ленив, чтобы залезть в долги Yonkors Gazette T Во время эпидемии паротита даже врач диспансера может похвастаться своими опухшими пациентами Buffalo Courier I Хотя человек, который приправляет колбасы, может и не быть философом, его часто окружает саго Курьер Лоуэлла. Епископ Худ сообщает, что только один цветной священник в этом штате употребляет табак. Жаль, что все больше белого духовенства не избегают его. Атчисон Глоуб Каждый раз, когда мужчина берет газету, он читает о какой-то новой еде. для маленьких детей Что стало со старомодным домашним творением Филадельфия Время Для китайца естественно немного волноваться по поводу закона Гири, но когда парочка из них собирает вместе язык, они использование ужасно I

Dixon Evening Telegraph из Диксона, штат Иллинойс, 26 марта 1974 г. · Стр. 17

ПЕРИЯ, ГОРОД ДИКСОН — ДОРОГИЕ ЦЕНЫ ДО ПОНЕДЕЛЬНИКА.49 BEFICOnLEBOt 202 СПИКАСТ БАРАБАН ».95 Вал. $ 049 Wrtf Olitoti «TECHMATIC AcMaxteBmd iit’GooO-eysNKfc Pyroil Концентрированное АВТОМАТИЧЕСКОЕ МОЮЩЕЕ СРЕДСТВО 32-OX. Рег. * 1.37 .87 ОДЕЯЛА ТВЕРДОГО ЦВЕТА Красивое одеяло 72 «X 90» с атласным переплетом из легкого в уходе 100% акрила. Не пил и не пилюлю. Очень тяжелый. На ваш выбор пламенный, сливовый или белый. СРАВНИТЬ С S6.99 GIUETTE nCHMATIC Super 10’s Vol. до «1.99 Теперь у Gibson .99 Настало время покупать УГОЛЬНЫЕ БРИКЕТЫ 10 фунтов. Сумка Рег. 87 «i DEP HERBAL SHAMPOO Придайте вашим волосам роскошь натуральных трав.Dep tor Men ШАМПУНЬ № 701 ПЛАСТИКОВЫЕ Гребни СРАВНИТЬ НА 19 & lt; Придает мужским волосам чистый сухой блеск m COVER GIRL 1.75-02. M.75 Value НА ЭТОЙ НЕДЕЛЕ НА GIBSON

Астрагалозид IV вызывает апоптоз, задержку фазы G1 и подавляет передачу антиапоптотических сигналов при гепатоцеллюлярной карциноме

Резюме

Предпосылки / цель: Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является первичным злокачественным новообразованием печени и третьей по значимости причиной смерти от рака во всем мире. Хотя для ГЦК доступны несколько вариантов химиотерапии, химиоиндуцированная токсичность неизбежна во время клинического лечения.Таким образом, определение возможных адъювантных агентов, обладающих как защитным, так и противоопухолевым действием, имеет решающее значение. Травяные препараты, такие как Juzen taiho-to и Sho-saiko-to, обладают химиопрофилактическим и анти-ГЦК действием. Астрагалозид IV — это соединение, извлеченное из китайской лечебной травы Astragalusmbranaceus (Fisch.) Bge. с потенциалом защиты печени. Однако остается неизвестным, может ли астрагалозид IV также обладать способностью подавлять опухоль и механизм, лежащий в основе его действия. Материалы и методы: анализ жизнеспособности, анализ клеточного цикла, анализ апоптоза, вестерн-блоттинг и транс-луночный анализ инвазии были выполнены для определения способности астрагалозида IV ингибировать опухоль на клетках HCC (клетки SK-Hep1 и Hep3B).Результаты. Мы обнаружили, что астрагалозид IV может вызывать цитотоксичность и внешний / внутренний эффект апоптоза, но также запускать остановку G ₁ в клетках HCC. Экспрессия антиапоптотических белков ГЦК снижалась астрагалозидом IV. Кроме того, астрагалозид IV также подавлял способность к инвазии клеток HCC. Заключение. Астрагалозид IV эффективно подавлял пролиферацию, инвазию и антиапоптоз клеток ГЦК in vitro.

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — это тип первичного злокачественного новообразования печени, наиболее часто встречающийся в США, Азии и Африке (1, 2).Инфекция вирусным гепатитом и длительное воздействие химических канцерогенов или токсинов растений могут вызвать злокачественную трансформацию гепатоцитов, приводящую к развитию ГЦК (3). Доклинические и клинические исследования показали, что лекарственные травы могут действовать как химиопротекторные средства, эффективно предотвращая образование ГЦК, вызванное вирусом гепатита С или токсичным агентом. Помимо химиопрофилактики, лекарственные травы также обладают потенциалом против ГЦК (4-6).

Juzen taiho-to (TJ-48), травяная формула, не только снижает гепатоканцерогенез за счет снижения провоспалительных цитокинов и окислительного стресса, но также увеличивает кумулятивную выживаемость без заболевания у пациентов с ГЦК (7) .Sho-saiko-to (TJ-9) и Stronger-Neo Minophagen C (SNMC, 0,2% глицирризин в сочетании с 2,0% глицином и 0,1% цистеином в физиологическом растворе) снижают риск ГЦК у пациентов с циррозом и хроническим гепатитом С. соответственно (8, 9). Кроме того, шо-сайко-то и глицирризин подавляли рост опухолевых клеток за счет индукции апоптоза и остановки фазы G ₁ в HCC in vitro и in vivo (10, 11).

Астрагалозид IV, биоактивное соединение, полученное из Astragalusmbranaceus , на животных моделях подавляет повреждения печени, вызванные ацетаминофеном и цисплатином (12, 13).Также было показано, что астрагалозид IV подавляет метастатическую активность за счет блокирования эпителиально-мезенхимального перехода при ГЦК (14). Однако механизм действия астрагалозида IV против ГЦК еще не выяснен. Таким образом, целью настоящего исследования было проверить влияние астрагалозида IV на прогрессирование клеточного цикла и выживаемость при HCC in vitro .

Материалы и методы

Химические вещества и реактивы. Астрагалозид IV, иодид пропидия и диметилсульфоксид (ДМСО) были получены от Sigma Chemical (St.Луис, Миссури, США). Культуральная среда Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM) с дополнительными 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% L-глутамином, была приобретена у Gibco BRL (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Трипсин-ЭДТА был получен от Invitrogen Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США). Набор для анализа активности активных каспаз-3, -8 и -9 для анализа проточной цитометрии был от Biovision (Маунтин-Вью, Калифорния, США). Буфер для лизиса клеток NP40 и набор для анализа Bio-Rad были приобретены в Thermo Fisher Scientific (Фремонт, Калифорния, США).

Культура клеток SK-Hep1 и Hep3B. Клеточные линии гепатоцеллюлярной карциномы человека SK-Hep1 и Hep3B были получены из Института исследований и разработок пищевой промышленности (Синьчжу, Тайвань, Китай). Клетки SK-Hep1 и Hep3B поддерживали в среде DMEM плюс 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамин, 100 Ед / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина. Клетки хранили в инкубаторе при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ и 95% воздуха.

Анализ жизнеспособности 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ). клетки SK-Hep1 и Hep3B высевали на 96-луночный планшет при плотности 3 × 10 ⁴ клеток / лунку и выращивали в течение ночи. К клеткам добавляли астрагалозид IV (0, 100, 150, 200, 300 и 400 мкМ). ДМСО (0,1%) служил в качестве контроля растворителя. Клетки поддерживали с лекарствами при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ и 95% воздуха в течение 48 часов. Затем среду заменяли свежей средой с реагентами МТТ (DMEM: МТТ = 9: 1) и инкубировали еще 4 ч при 37 ° C. Наконец, ДМСО использовали для растворения реагентов МТТ для измерения оптической плотности при 570 нм с помощью SpectraMax iD3 (Molecular Device, Сан-Хосе, Калифорния, США) (16).

Анализ образования колоний. Анализ образования клонов использовали для тестирования пролиферации клеток. Клетки SK-Hep1 и Hep3B высевали на 6-луночный планшет в течение ночи и обрабатывали астрагалозидом IV (0, 200 и 400 мкМ) в течение 48 часов. Обработанные клетки обрабатывали 0,25% трипсином (Sigma-Aldrich), подсчитывали, ресуспендировали в 10-сантиметровой чашке и выдерживали при 37 ° C в течение 2 недель. Затем культивированные клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали в параформальдегиде (Sigma-Aldrich) в течение 20 мин и окрашивали 0.2% кристаллический фиолетовый (Solarbio, Пекин, Китай) на 10 мин. Окрашенные клетки промывали PBS и фотографировали с помощью камеры Olympus XZ-1 (17). Количественный анализ колоний выполняли с помощью программного обеспечения Image J 1.490 (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США).

Анализ клеточного цикла. Клетки SK-Hep1 и Hep3B высевали на 6-луночный планшет при плотности 5 × 10 ⁵ клеток / лунку и выращивали в течение ночи. Затем клетки обрабатывали 200 мкМ астрагалозида IV в течение 0, 6, 12, 24 и 48 часов соответственно.После обработки клетки собирали, фиксировали 70% этаналом и хранили при -20 ° C в течение ночи. Наконец, клетки центрифугировали и окрашивали окрашивающим раствором йодида пропидия (BD Pharmingen ™, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) в темноте при 37 ° C в течение 30 минут. Затем распределение клеточного цикла было получено с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur; Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) и количественно определено с помощью системы FlowJo 7.6.1 (18).

Окрашивание аннексином-V. Клетки SK-Hep1 и Hep3B высевали на 6-луночный планшет при плотности 5 × 10 ⁵ клеток / лунку для выращивания в течение ночи и обрабатывали астрагалозидом IV (0, 200 и 400 мкМ) в течение 48 часов.Наконец, клетки центрифугировали и окрашивали с помощью набора для обнаружения апоптоза аннексин-V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) (Vazyme Biotech Co. Ltd, Нанкин, Китай). Затем паттерн экспрессии аннексина-V получали с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur; Becton-Dickinson) и количественно оценивали с помощью системы FlowJo 7.6.1, как описано ранее (19).

Анализ активности каспазы-3, каспазы-8 и каспазы-9. Проточная цитометрия использовалась для измерения активности расщепленной каспазы-3, -8 и -9 в клетках SK-Hep1 и Hep3B после воздействия астрагалозида IV.Клетки SK-Hep1 и Hep3B высевали на 6-луночный планшет при плотности 5 × 10 ⁵ клеток / лунку в течение ночи и обрабатывали астрагалозидом IV (0, 200 и 400 мкМ) в течение 48 часов. Клетки собирали и ресуспендировали в 300 мкл фосфатно-солевого буфера или 1 мкл раствора субстрата, содержащего FITC-Asp (OCH ₃ ) -Glu (OCH ₃ ) -Val-Asp (OCH ₃ ) -фторметилкетон. (DEVD-FMK) для каспазы-3 или содержащий сульфородамин-Ile-Glu-Thr-Asp-фторметилкетон (Red-IETD-FMK) для каспазы-8 или содержащий FITC-Leu-Glu-His-Asp-фторметилкетон ( LEHD-FMK) для активности каспазы-9 в течение 30 мин при 37 ° C с 5% CO ₂ .В конце все образцы были изолированы, промыты фосфатно-солевым буфером и измерены активности каспазы-3, -8 и -9 с помощью проточной цитометрии, как описано ранее (20).

Вестерн-блоттинг. Клетки SK-Hep1 и Hep3B (2 × 10 ⁶ клеток на чашку) поддерживали в 10-сантиметровых чашках с культуральной средой в течение ночи, а затем инкубировали с 0, 200 или 400 мкМ астрагалозида IV в течение 48 часов. Клетки выделяли и лизировали буфером для лизиса клеток NP-40. Лизат клеток центрифугировали при 21,500 × g в течение 30 минут при 4 ° C с последующим количественным определением общего белка с использованием набора для анализа Bio-Rad с использованием в качестве контроля белка.Белки разделяли электрофорезом в 10-12% додецилсульфат-полиакриламидном геле и переносили электропереносом на поливинилидендифторидную мембрану (Thermo Fisher Scientific). После этого следовала инкубация с первичными антителами, а затем промывка с последующими вторичными антителами. Наконец, мембрану визуализировали с помощью набора для усиленной хемилюминесценции (Thermo Fisher Scientific), как описано ранее (21, 22). Первичные антитела, перечисленные ниже, были использованы и приобретены у различных компаний: X-связанный ингибитор белка апоптоза (XIAP; Thermo Fisher Scientific), лейкоз миелоидных клеток 1 (MCL1; BioVision), FADD-подобный интерлейкин 1β-превращающий фермент-ингибиторный белок (c -FLIP; Cell signaling Technology, Danvers, MA, USA), сурвивин (Abcam Plc., Кембридж, Великобритания) и β-актин (Thermo Fisher Scientific). Вторичные конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела против кроличьих или против мышиных IgG были приобретены в Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA).

Анализ инвазии. Клетки SK-Hep1 и Hep3B (2 × 10 ⁶ клеток на чашку) поддерживали в 10-сантиметровых чашках с культуральной средой в течение ночи, а затем инкубировали с 0, 200 или 400 мкМ астрагалозида IV в течение 48 часов. Апикальная камера была покрыта 50 мкл матригеля за день до эксперимента.Затем клетки трипсинизировали, собирали, подсчитывали, ресуспендировали с помощью 100 мкл бессывороточной среды в апикальной камере трансвеллта в количестве 1 × 10 ⁶ клеток / лунку. После 48-часовой инкубации клетки фиксировали и окрашивали 0,5% раствором кристаллического фиолетового. Клетки наконец-то были сфотографировали с помощью светового микроскопа Nikon ECLIPSE Ti-U при × 100 и количественно оценили с помощью программного обеспечения ImageJ версии 1.50 (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США) (20).

Жизнеспособность и пролиферация клеток гепатоцеллюлярной карциномы подавлялась астрагалозидом IV.Клетки SK-Hep1 и Hep3B обрабатывали астрагалозидом IV (0-400 мкМ) в течение 48 часов и выполняли МТТ и анализ образования колоний. Отображаются результаты жизнеспособности клеток SK-Hep1 (A) и Hep3B (B). C: Отображаются репрезентативные изображения колоний из каждой группы. D: Количественное определение количества колоний в каждой группе отображается в виде гистограммы. Значительно отличается при * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с 0 мкМ астрагалозида IV.

Статистический анализ. Данные представлены как среднее ± стандарт.Тест Стьюдента t (односторонний) использовался для сравнения между группами. Значения p <0,05 считали статистически значимой разницей. Анализы выполняли с использованием GraphPad Prism версии 7.0 (GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США).

Результаты

Астрагалозид IV вызывал цитотоксичность и подавлял пролиферацию клеток HCC. Чтобы определить, может ли астрагалозид IV вызывать токсичность и подавлять пролиферацию клеток HCC, мы обрабатывали клетки SK-Hep1 и Hep3B увеличивающимися дозами астрагалозида IV от 0 до 400 мкМ в течение 48 часов.Как показано на фиг. 1A и B, жизнеспособность клеток SK-Hep1 и Hep3B снижалась астрагалозидом IV дозозависимым образом. Кроме того, анализ образования колоний использовали для подтверждения ингибирования пролиферации астрагалозидом IV. На рисунке 1C образование колоний было эффективно уменьшено обработкой астрагалозидом IV. Более высокие концентрации астрагалозида IV лучше подавляли пролиферацию клеток SK-Hep1 и Hep3B (рис. 1D). Подводя итог, можно сказать, что жизнеспособность и пролиферация клеток SK-Hep1 и Hep3B заметно подавлялись обработкой астрагалозидом IV.

Астрагалозид IV индуцировал остановку фазы G ₁ и апоптоз клеток HCC. Затем мы исследовали влияние астрагалозида IV на распределение клеточного цикла и апоптоз с помощью проточной цитометрии. Астрагалозид IV эффективно запускал задержку G ₁ клеток SK-Hep1 и Hep3B (рис. 2A и B, соответственно). Кроме того, апоптоз (аннексин-V) клеток HCC также был вызван лечением астрагалозидом IV дозозависимым образом (рис. 2C). Расщепление каспазы-3, признанного маркером апоптоза, было значительно увеличено астрагалозидом IV (рис. 2D).Процент расщепленной каспазы-3 увеличивался после 48-часовой обработки 200 мкМ астрагалозида IV и при обработке 400 мкМ астрагалозида IV (фигура 2D) в клетках SK-Hep1 и Hep3B. Взятые вместе, эти данные показывают, что астрагалозид IV может не только запускать блокировку клеток SK-Hep1 и Hep3B в фазе G ₁ , но также способствовать апоптозу.

G ₁ — Астрагалозид IV вызывает остановку фазы и апоптоз в клетках гепатоцеллюлярной карциномы. Клетки SK-Hep1 и Hep3B обрабатывали без или с 200 или 400 мкМ астрагалозида IV в течение 0-48 часов и подтверждали анализом клеточного цикла, аннексином-V и активным окрашиванием каспазой-3.Распределение в клеточном цикле клеток SK-Hep1 (A) и Hep3B (B) после обработки 200 мкМ астрагалозидом IV. Значительно отличается при * p <0,05, ** p <0,01 по сравнению с 0 мкМ астрагалозида IV. C: Характер экспрессии аннексина-V после 48-часовой обработки астрагалозидом IV и количественная оценка результатов анализа аннексина V. D: Модель экспрессии расщепленной каспазы-3 и количественная оценка результатов анализа расщепленной каспазы-3 после 48-часовой обработки астрагалозидом IV. Значительно отличается при ** p <0,01 по сравнению с 0 мкМ астрагалозида IV; ^## p <0.01 по сравнению с 200 мкМ астрагалозида IV.

Расщепление каспазы-8 и -9 было индуцировано астрагалозидом IV на клетках гепатоцеллюлярной карциномы. Клетки SK-Hep1 и Hep3B обрабатывали астрагалозидом IV 0, 200 или 400 мкМ в течение 0-48 часов и подтверждали активным окрашиванием каспазой-8 и -9. A: Модель активации расщепленной каспазы-8 после лечения астрагалозидом IV и количественная оценка результатов. B: Модель активации расщепленной каспазы-9 после лечения астрагалозидом IV и количественная оценка результатов.Значительно отличается при ** p <0,01 по сравнению с 0 мкМ астрагалозида IV; ^## p <0,01 по сравнению с 200 мкМ астрагалозида IV.

Астрагалозид IV активировал зависимую от каспазы-8 внешнюю и зависимую от каспазы-9 внутреннюю передачу сигналов апоптоза клеток ГЦК. Мы далее исследовали, был ли апоптоз, запускаемый астрагалозидом IV, опосредован внешней или внутренней передачей сигналов апоптоза. Здесь мы оценили активацию родственных маркеров, включая внешнюю апоптоз-зависимую каспазу-8 и внутреннюю апоптоз-зависимую каспазу-9.Как показано на фиг. 3A, расщепление каспазы-8 было значительно увеличено астрагалозидом IV как в клетках SK-Hep1, так и в клетках Hep3B. Кроме того, активация расщепленной каспазы-9 также значительно увеличивалась астрагалозидом IV (рис. 3B). Таким образом, апоптоз, индуцированный астрагалозидом IV, опосредуется как внешней, так и внутренней передачей сигналов апоптоза.

Астрагалозид IV эффективно подавлял экспрессию антиапоптотических белков. После подтверждения апоптотического эффекта астрагалозида IV мы дополнительно исследовали, могут ли эффекты астрагалозида IV также включать экспрессию антиапоптозных и связанных с пролиферацией факторов с помощью вестерн-блоттинга.На фиг. 4 (левые панели) экспрессия XIAP, MCL1, C-FLIP и сурвивина снижалась астрагалозидом IV дозозависимым образом как в клетках SK-Hep1, так и в Hep3B. Путем количественного анализа было обнаружено, что относительная экспрессия антиапоптозных белков снижена в группах, получавших астрагалозид IV (рис. 4, правые панели). В заключение, астрагалозид IV успешно подавлял экспрессию белков, связанных с антиапоптотическими и пролиферативными эффектами в клетках HCC.

Антиапоптотические белки были восстановлены астрагалозидом IV на клетках HCC. Клетки SK-Hep1 и Hep3B обрабатывали астрагалозидом IV (0, 200 или 400 мкМ) в течение 0-48 часов и экспрессировали X-связанный ингибитор апоптозного белка (XIAP), миелоидноклеточного лейкоза 1 (MCL1), FADD-подобного интерлейкина. Белок, ингибирующий -1β-превращающий фермент (c-FLIP), и белки сурвивина были подтверждены вестерн-блоттингом (левая панель) и количественно (правая панель) в SK-Hep1 (A) и Hep3B (B). Значительно отличается при * p <0,05, ** p <0.01 против 0 мкМ астрагалозида IV; ^## p <0,01 по сравнению с 200 мкМ астрагалозида IV.

Астрагалозид IV заметно ингибировал инвазию клеток HCC. Чтобы определить, может ли астрагалозид IV также подавлять инвазионную способность клеток HCC, мы выполнили анализ инвазии через лунки. Количество инвазивных клеток SK-Hep1 и Hep3B значительно подавлялось астрагалозидом IV, как показано на мембранах трансвелл (рис. 5). Количественная оценка показала резкое подавление инвазии ГЦК астрагалозидом IV.

Обсуждение

Апоптоз модулируется апоптотическими сигнальными каскадами. Противораковые агенты вызывают тяжелое повреждение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), а взаимодействие с рецепторами гибели / лигандами рецепторов гибели клеточной мембраны инициирует апоптоз через внутренние и внешние пути апоптоза (23). Члены семейства каспаз являются важными компонентами апоптотического ответа. Расщепленные каспазы-9 и -8 в качестве активатора регулируют восходящую активацию каспаз во внутреннем и внешнем путях апоптоза, соответственно.Расщепленная каспаза-3 в качестве исполнителя участвует в формировании апоптотической фрагментации ДНК и расщеплении белка репарации ДНК поли (АДФ-рибоза) полимеразы-1 (PARP1) (24). Наши данные продемонстрировали, что астрагалозид IV значительно индуцировал апоптоз и увеличивал активацию расщепленных каспаз-3, -8 и -9 в клетках HCC SK-Hep1 и Hep3B (рисунки 2D и 3).

Инвазивная способность клеток гепатоцеллюлярной карциномы подавлялась астрагалозидом IV. Клетки SK-Hep1 и Hep3B обрабатывали 0, 200 или 400 мкМ в течение 0-48 ч астрагалозидом IV перед проведением анализа инвазии через лунки.A: Изображения трансвеллентных мембран клеток SK-Hep1 и Hep3B после обработки астрагалозидом IV. B: Количественная оценка клеток инвазии, рассчитанная с использованием пяти различных изображений из каждой группы. Значительно отличается при * p <0,05, ** p <0,01 по сравнению с 0 мкМ астрагалозида IV; ^## p <0,01 по сравнению с 200 мкМ астрагалозида IV.

Уклонение от апоптоза и аберрантная прогрессия клеточного цикла способствуют прогрессированию опухоли. Сверхэкспрессия антиапоптотических белков (XIAP, MCL1, C-FLIP и сурвивин) обладает способностью ослаблять терапевтическую эффективность противоопухолевых средств посредством блокирования апоптоза, опосредованного внутренними и внешними путями.Снижение экспрессии антиапоптотических белков было связано с благоприятным прогнозом у пациентов с ГЦК (18, 25). Ингибиторы циклинзависимых киназ (CDK) 4/6 нарушают прогрессирование клеточного цикла, вызывая остановку фазы G ₁ при различных типах рака (15). Было продемонстрировано, что пальбоциклиб, ингибитор циклин-зависимой киназы 4 и 6, одобренный для пациентов с раком груди, подавляет рост опухолевых клеток и способствует остановке фазы G ₁ при ГЦК (26). Наши результаты показали, что астрагалозид IV явно ослабляет экспрессию антиапоптотических белков (XIAP, MCL-1, C-FLIP и сурвивин) (рис. 4) и индуцирует остановку фазы G ₁ в клетках HCC SK-Hep1 и Hep3B (рис. 2А и Б).

В заключение, астрагалозид IV не только запускает апоптоз через внутренние / внутренние пути и остановку фазы G ₁ , но также снижает клеточную инвазию (рис. 5) и антиапоптозные механизмы при ГЦК.

Выражение признательности

Это исследование финансировалось Мемориальной больницей Шоу Чван, Чанхуа, Тайвань, Китай (идентификатор гранта: RD-108034).

Сноски

• Вклад авторов

  Обработка данных: Чун-Мин Су, Сяо-Чиа Ван, Фей-Тинг Сюй; Финансирование: Чун-Мин Су; Методология: Чун-Мин Су, Чун-Хуэй Лу и Чиен-Кай Лай; Подтверждение: Цзин-Гунг Чунг и Ю-Ченг Куо; Написание — первоначальный набросок: Фэй-Тин Сю и Ю-Ченг Куо; Написание — просмотр и редактирование: Цзин-Гунг Чунг и Ю-Ченг Куо.

• Эта статья находится в свободном доступе в Интернете.

• Конфликт интересов

  Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данного исследования.

• Получено 19 ноября 2019 г.
• Исправление получено 26 ноября 2019 г.
• Принято 28 ноября 2019 г.

• Авторские права © 2020, Международный институт противораковых исследований (д-р Джордж Дж. Делинасиос) Все права защищены

% PDF-1.4 % 147 0 объект > эндобдж xref 147 76 0000000016 00000 н. 0000002856 00000 н. 0000003008 00000 п. 0000003044 00000 н. 0000003637 00000 н. 0000003680 00000 н. 0000003819 00000 н. 0000003958 00000 н. 0000004096 00000 н. 0000004496 00000 н. 0000005279 00000 н. 0000005857 00000 н. 0000006551 00000 н. 0000007026 00000 н. 0000007514 00000 н. 0000008263 00000 н. 0000008998 00000 н. 0000009451 00000 п. 0000009765 00000 н. 0000010161 00000 п. 0000010642 00000 п. 0000010756 00000 п. 0000010868 00000 п. 0000010955 00000 п. 0000011548 00000 п. 0000012147 00000 п. 0000012824 00000 п. 0000012952 00000 п. 0000014410 00000 п. 0000015598 00000 п. 0000015770 00000 п. 0000016175 00000 п. 0000016264 00000 п. 0000016620 00000 п. 0000017045 00000 п. 0000017150 00000 п. 0000017863 00000 п. 0000018166 00000 п. 0000018489 00000 п. 0000019669 00000 п. 0000020838 00000 п. 0000021168 00000 п. 0000021542 00000 п.